GSNOR通过调控线粒体蛋白COX6B的S-亚硝基化影响胶孢炭疽菌生长、致病性与胁迫抗性的分子机制

本研究揭示了谷胱甘肽S-亚硝基化还原酶（GSNOR）通过调控线粒体细胞色素c氧化酶亚基6B（COX6B）的S-亚硝基化（S-nitrosylation），在胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的生长、致病性和氧化应激响应中的核心作用。该发现为靶向NO信号通路的抗真菌策略提供了新思路。

　　

Identification of CgGSNOR and construction of the mutant strains
研究通过基因组比对鉴定出胶孢炭疽菌中高度保守的GSNOR同源基因CgGSNOR，其编码的蛋白包含典型的酒精脱氢酶结构域（ADH_N和ADH_zinc_N）。系统发育分析显示该基因与禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）等植物病原真菌同源性强。通过Split-Marker重组策略构建的ΔCgGSNOR突变体及其回补株系（Res-ΔCgGSNOR）为后续功能研究奠定基础。

Functional analysis of CgGSNOR in colony morphology, conidiation, and germination
ΔCgGSNOR突变体在PDA和MM培养基上菌落直径显著减小，分生孢子产量降低7倍以上，且孢子长宽比增加。尽管萌发率未受影响，但突变体芽管长度显著缩短，表明CgGSNOR缺失导致早期发育缺陷。这些表型变化暗示NO稳态失衡对真菌形态建成的广泛影响。

Pathogenicity and infection structure development of CgGSNOR mutant strains
致病性实验显示ΔCgGSNOR在完整橡胶树叶和苹果果实上病斑面积减少80%，而伤口接种仅部分恢复致病力。显微观察发现突变体附着胞形成率降至10%，且结构异常；穿透洋葱表皮实验证实其侵入菌丝（IH）形成率不足5%。这些结果揭示GSNOR通过调控NO水平影响侵染结构的机械穿透能力。

CgGSNOR regulates NO accumulation, O₂
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levels, and ATP production
DAF-FM DA荧光探针检测显示ΔCgGSNOR内NO积累增加2.5倍，而线粒体超氧化物（O₂
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）水平下降40%。ATP含量测定表明突变体能量代谢受损，产量仅为野生型的60%。共定位实验证实ROS主要源于线粒体，说明GSNOR缺失导致氧化还原失衡与能量危机。

Proteomic analysis of S-nitrosylated mitochondrial proteins
线粒体蛋白质组学鉴定出207个S-亚硝基化修饰位点，其中电子传递链（ETC）关键组分CgCOX6B的Cys73位点修饰水平在突变体中显著上调。热图分析显示ETC复合体蛋白和次级代谢酶类修饰变化最显著，提示线粒体功能是NO信号的核心靶标。

Functional validation of Cytochrome c oxidase subunit 6B (COX6B)
ΔCgCOX6B突变体完全丧失对完整叶片的侵染能力，苹果病斑面积减少90%。尽管附着胞形成率正常，但50% PEG8000渗透压胁迫下其坍塌率增加3倍。细胞穿透实验显示突变体无法穿透纤维素膜，且线粒体ATP生成减少70%，证实COX6B是维持侵染压力的能量枢纽。

Structural modeling reveals conformational changes in CgCOX6B
AlphaFold预测显示CgCOX6B通过Cys42-Cys62和Cys32-Cys73二硫键稳定螺旋结构。S-亚硝基化导致溶剂可及表面积（SASA）减少15%，其中Cys73修饰引起最大构象偏移（RMSD=2.887），从原子层面阐释了翻译后修饰影响蛋白功能的机制。

Synergistic effects with fungicides
ΔCgCOX6B对杀菌剂异菌脲（Iprodione）的敏感性增加5倍。10 mmol/L NO供体SNP与异菌脲联用产生协同效应，抑制率提升26%。这一发现为通过调控NO水平增强现有杀菌剂效能提供了实验依据。

DISCUSSION
研究构建了GSNOR-COX6B调控轴模型：CgGSNOR通过降解S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）维持NO稳态，其缺失导致ETC复合体亚基过度S-亚硝基化，特别是COX6B关键半胱氨酸（Cys42/62/73）修饰引发线粒体能量代谢紊乱，最终削弱附着胞膨压和宿主穿透能力。该机制为开发靶向NO-线粒体通路的广谱抗真菌剂提供了理论支撑。