"SMART技术：多重基因组工程方法编程烈性噬菌体及其在跨物种裂解中的应用"

这篇研究开创性地开发了SMART（分裂-修饰-组装-重启）技术，通过将烈性噬菌体基因组分割克隆至细菌人工染色体（BAC），克服了毒性基因产物对大肠杆菌宿主的抑制，实现了T7噬菌体8个位点并行编辑和10%基因组精简。该技术成功构建了能同时裂解大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的合成噬菌体，为定制化噬菌体治疗提供了高效平台。

　　

分裂烈性噬菌体基因组为可克隆片段
研究团队首先尝试克隆ΦX174噬菌体全基因组时遭遇失败，发现除裂解蛋白E基因外还存在其他毒性成分。通过将5.4kb基因组分割为1.9kb和3.4kb两个片段并克隆至低拷贝BAC载体，成功实现稳定复制。针对39.9kb的T7噬菌体，初始分割的8个~5kb片段中S1、S3、S6因含毒性基因（如编码蛋白激酶的gp0.7）无法克隆，最终通过精细拆分获得10个1.2-7.8kb的可操作片段，其中7.8kb的F6-F7融合片段创下克隆记录。

高效组装技术比较
研究对比了三种组装方法：体外Gibson组装、体内RecET重组以及二者结合的ExoCET。对于ΦX174，ExoCET产生1,083±108 PFU（噬斑形成单位），显著高于其他方法；在更复杂的T7组装中，ExoCET以84±19 PFU的产量成为唯一可行方案，证明其对于多片段组装的独特优势。

T7噬菌体基因组精简工程
利用Red-ccdB双轮重组系统，团队在BAC载体上并行删除了gp0.4-gp0.7等8个非必需基因区（总计3.9kb）。构建的T7-B底盘噬菌体保留90.2%基因组，虽裂解效率略有下降（爆发量从224±9降至197±9），但为外源基因插入腾出空间。值得注意的是，gp19.5基因的单独缺失导致噬斑面积显著缩小，提示这个功能未知的基因在感染过程中起关键作用。

外源基因表达特性图谱
通过在不同位点插入荧光素酶报告基因，发现T7启动子驱动的表达存在294倍差异：gp10位点活性最高，gp1.4最低。比较两种启动子显示，T7启动子在gp10位点的表达量是J23119启动子的4.6倍，但在gp5.3位点却低于后者。插入容量测试表明，野生型T7无法承载>3kb外源片段，而T7-B底盘能在gp5.3/gp7.7/gp10位点稳定携带3kb片段（经10代传代验证），其中gp5.3位点的5kb插入会导致噬菌体遗传不稳定。

跨物种裂解合成噬菌体的构建
选择表达活性最高的gp7.7和gp10位点，分别插入金黄色葡萄球菌噬菌体的LysGH15裂解酶（1.6kb）和无乳链球菌噬菌体的LyJDSS3裂解酶（0.8kb）。SDS-PAGE证实重组噬菌体成功表达带His标签的裂解酶，共培养实验显示：T7-B-GJ能同时裂解三种细菌（大肠杆菌OD₆₀₀
在4小时内降至0.2），虽裂解酶存在交叉活性，但工程噬菌体在10次传代后仍保持100%遗传稳定性。该体系首次实现单个噬菌体对变形菌门（大肠杆菌）和厚壁菌门（金黄色葡萄球菌/无乳链球菌）的跨门裂解。

技术优势与应用前景
相比传统BRED（噬菌体重组电穿孔DNA）方法，SMART技术具有三大突破：①通过BAC分割规避毒性基因限制；②实现多位点并行编辑；③无需繁琐筛选即可获得纯化重组体。研究者特别指出，早期/中期宿主互作基因更易呈现毒性，这为其他噬菌体工程化提供了拆分策略参考。该技术为构建具有增强疗效、扩展宿主谱和可编程行为的定制噬菌体开辟了新途径，有望解决临床上面临的抗生素耐药性危机。