AMBRA1 E3泛素连接酶受体识别D型细胞周期蛋白的分子机制及其在肿瘤治疗中的潜在应用

本研究揭示了AMBRA1作为CRL4DDB1 E3泛素连接酶的底物识别亚基，通过其WD40结构域特异性识别磷酸化修饰的D型细胞周期蛋白（Cyclin D1/D2/D3）C端降解信号，解析了3.55?冷冻电镜结构，阐明了Thr286磷酸化依赖的底物识别机制。该研究为靶向异常Cyclin D活性的癌症治疗提供了新策略。

　　

论文解读
在细胞周期调控的精密交响乐中，D型细胞周期蛋白（Cyclin D）如同指挥家手中的节拍器，通过激活CDK4/6激酶驱动G₁期进程。然而这位"指挥家"的失控演出——其过度积累或异常激活——已成为多种癌症的标志性事件。尽管已知泛素-蛋白酶体系统(UPS)负责清除Cyclin D，但E3泛素连接酶如何精准识别这些"问题蛋白"的分子密码，始终是悬而未决的科学谜题。

这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究犹如一部结构生物学的侦探小说，科研团队通过冷冻电镜技术捕捉到了关键证据：AMBRA1-DDB1复合物与Cyclin D1结合的3.55?高分辨率结构。研究显示，AMBRA1的WD40结构域如同特制锁具，其顶部表面存在由F57/W99/H75/R96残基构成的磷酸化依赖型识别模块，专门识别Cyclin D1 C端经Thr²⁸⁶磷酸化后形成的转角-3₁₀螺旋复合构象。这种特异性识别使得CRL4^AMBRA1复合物能够对Cyclin D进行精准"标记"，引导其进入蛋白酶体降解途径。

关键技术方法
研究采用Expi293F细胞共表达系统制备DDB1-AMBRA1^WD40-Cyclin D1-CDK4_EE复合物，通过单颗粒冷冻电镜解析结构。结合AlphaFold3预测模型验证D型细胞周期蛋白结合模式，利用等温滴定量热法(ITC)测定结合亲和力，并开展体外泛素化实验和细胞DNA损伤检测。质谱分析证实Cyclin D1 Thr²⁸⁶磷酸化修饰。

研究结果

1. DDB1-AMBRA1^WD40结合Cyclin D1-CDK4的结构特征
   冷冻电镜结构显示，AMBRA1通过N端螺旋-环-螺旋基序与DDB1的BPA/BPC双β-螺旋桨结构域结合，其WD40结构域形成七叶β-螺旋桨。仅Cyclin D1最后11个残基(C285-I295)在密度图中清晰可见，呈现磷酸化依赖的折叠构象。

2. AMBRA1^WD40与Cyclin D1的分子相互作用
   pThr²⁸⁶磷酸基团与AMBRA1的R96/H75形成氢键网络，下游疏水残基(V290/V293/I295)嵌入由F57/W99构成的疏水口袋。关键残基突变实验证实该界面对于Cyclin D1结合不可或缺。

3. AMBRA1^WD40识别D型细胞周期蛋白的普遍机制
   AlphaFold3预测显示Cyclin D2/D3 C端以相似模式结合AMBRA1。体外实验证实所有D型细胞周期蛋白均依赖保守Thr磷酸化位点与AMBRA1结合，其突变体(T286A/T280A/T283A)均丧失相互作用能力。

4. AMBRA1介导的泛素化调控
   体外泛素化实验显示AMBRA1^WD40可特异性介导Cyclin D1 K269位点的多聚泛素化，该过程严格依赖Thr²⁸⁶磷酸化。关键结合位点突变体(F57A/W99R等)均丧失泛素化活性。

5. AMBRA1-cyclin D1互作缺陷导致DNA损伤
   U2OS细胞实验表明，AMBRA1缺失或结合界面突变会导致Cyclin D1积累，在CHK1抑制剂AZD7762处理下显著增加γH2AX标记的DNA损伤灶，证实该互作对基因组稳定性的关键作用。

研究结论与意义
该研究首次在原子水平揭示了AMBRA1通过"磷酸化密码"识别D型细胞周期蛋白的分子机制，阐明了CRL4^AMBRA1复合物调控细胞周期进程的结构基础。特别值得注意的是：

1. 肿瘤治疗新靶点：AMBRA1结合界面残基在多种癌症中发生突变，针对该互作界面的小分子调控剂可能克服CDK4/6抑制剂耐药性。
2. 降解技术新思路：研究为开发靶向Cyclin D的PROTAC分子提供了精确的E3-底物结合模板。
3. 动态调控范式：WD40结构域与长无序区的组合可能使AMBRA1成为连接细胞周期、自噬等多通路调控的枢纽。

这项研究不仅解答了领域内关于D型细胞周期蛋白降解识别的长期疑问，更通过结构生物学与细胞生物学的完美融合，为癌症靶向治疗开辟了新的可能性。正如研究者所展望的，基于AMBRA1-Cyclin D互作界面的药物设计，或将谱写下一代肿瘤治疗的新篇章。