正痘病毒核心蛋白A4的O-连接N-乙酰葡糖胺修饰鉴定及其生物学意义解析

这篇研究首次系统鉴定了痘苗病毒（VACV）核心蛋白A4的多位点O-GlcNAc修饰，通过点击化学（click chemistry）、质谱（ETD MS）和基因敲除技术证实该修饰由宿主O-GlcNAc转移酶（OGT）催化，且修饰缺失不影响病毒体外复制，为病毒劫持宿主翻译后修饰机制提供了新范例。

　　

ABSTRACT
O-GlcNAcylation作为一种可逆的丝氨酸/苏氨酸翻译后修饰，在细胞信号传导和应激反应中起关键作用。本研究聚焦痘苗病毒（VACV）核心蛋白A4的O-GlcNAc修饰，揭示了这一古老发现的分子机制。

INTRODUCTION
VACV作为正痘病毒属代表，其复制全程在胞质中进行。早期研究曾发现一个40 kDa病毒粒子蛋白能被³H-葡糖胺标记，但修饰性质长期未明。本研究结合现代技术，提出该修饰实为O-GlcNAc的假说。

RESULTS

40 kDa O-GlcNAc病毒粒子蛋白的检测
通过GalT1(Y289L)突变体介导的点击化学标记，在感染细胞和纯化病毒中特异性检测到40 kDa生物素化蛋白。红外染料标记和聚乙二醇生物素（PEG-Biotin 10 kDa）质量标签实验显示该蛋白存在多位点修饰。

A4作为O-GlcNAc蛋白的鉴定
质谱分析锁定四个候选蛋白，其中核心结构蛋白A4经PEG-Biotin标记后出现60 kDa和>100 kDa条带，提示多重修饰。牛痘病毒（CPXV）同源蛋白同样显示42 kDa修饰条带。A4-YFP融合蛋白的免疫共沉淀实验进一步验证其O-GlcNAc修饰特征。

A4是唯一的O-GlcNAc修饰病毒蛋白
构建A4L基因敲除病毒（vΔA4）后，纯化病毒粒子中40 kDa修饰信号完全消失，证实A4是病毒粒子中唯一或主要O-GlcNAc修饰蛋白。该突变体病毒颗粒虽保有正常蛋白组成，但感染性显著降低。

A4蛋白中O-GlcNAc修饰位点的鉴定
电子转移解离质谱（ETD MS）鉴定出Ser96、Thr155、Thr172和Thr248等修饰位点，其中79%位于AlphaFold2预测的固有无序区域。值得注意的是，Thr79和Thr85位点存在复杂的HexNAc-Hex混合修饰。

宿主OGT介导修饰的机制验证
尽管VACV H3蛋白具有糖基转移酶结构域，但其活性位点突变体（E125A/D127A）和缺失突变体（vΔH3-GFP）均不影响A4修饰。OGT抑制剂OSMI-4处理使修饰水平降低90%，而OGT降解细胞系（MEF-iOGT）中dTAG-13诱导的OGT清除导致A4修饰完全消失。

DISCUSSION
研究揭示了宿主OGT对病毒核心蛋白的"劫持"现象：A4作为高度保守的病毒组装必需蛋白，其多位点O-GlcNAc修饰虽在体外非必需，但可能通过调控蛋白相互作用或稳定性影响体内感染过程。该发现为理解病毒利用宿主翻译后修饰网络的进化策略提供了新视角。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：点击化学标记（CuAAC/SPAAC）、重组病毒构建（vA4-YFP/vΔA4）、OGT条件性降解系统（dTAG-13）、以及结合trypsin/α-lytic protease的多酶切策略提升ETD MS覆盖度。所有实验均设严格对照并通过三次独立重复验证。