鸭坦布苏病毒E蛋白A487位点通过增强病毒组装和复制效率显著提高昆明小鼠神经毒力

本研究揭示了鸭坦布苏病毒（TMUV）E蛋白跨膜结构域（TMD）中V487A自然突变通过增强病毒粒子组装效率，显著提升病毒在小鼠脑内的复制能力和神经毒力。通过反向遗传学技术构建的CQW1-7M重组病毒证实，该突变是导致TMUV系统发育簇2.2（Cluster 2.2）比簇2.1（Cluster 2.1）毒力增强的关键分子决定因素，为理解禽源黄病毒（Orthoflavivirus）跨物种传播的分子机制提供了重要依据。

　　

不同TMUV毒株在小鼠模型中呈现显著神经毒力差异
研究团队通过颅内（i.c.）接种比较了三种鸭源TMUV毒株（CHN-YC、CQW1和SCS01）在昆明小鼠中的致病性。Cluster 2.2毒株CHN-YC表现出最强的神经侵袭性，感染后4天即引发显著体重下降（P<0.001），6-7天内导致100%死亡率（8/8），脑组织病毒滴度高达10^3.875 TCID₅₀。相比之下，Cluster 2.1毒株CQW1仅引起37.5%死亡率（3/8），而SCS01毒株仅导致12.5%死亡（1/8）。值得注意的是，腹腔（i.p.）接种均未建立有效感染，提示TMUV的神经侵袭具有严格的接种途径依赖性。

E-NS1区自然突变决定毒力表型
全基因组比对发现，Cluster 2.1毒株在E-NS1区存在19个特征性氨基酸变异。通过反向遗传学将7个关键突变（E-N277S/V487A，NS1-K48E/T112M/A274V/I318T/I338T）引入CQW1骨架构建的CQW1-7M重组病毒，在小鼠中重现了Cluster 2.2的高毒力表型：90%死亡率（9/10），临床评分达7.45分，脑内病毒载量较野生型提高10倍。单点突变验证实验显示，E蛋白第487位缬氨酸→丙氨酸（V487A）是核心毒力决定因子，该突变使小鼠存活率骤降至10%（1/10）。

跨膜结构域突变增强病毒组装机制
结构建模显示，E-V487A位于E蛋白第二个跨膜结构域（TM2）中部，该区域富含疏水氨基酸。通过纳米荧光素酶（NanoLuc）报告系统检测发现，V487A使病毒包装效率提升3倍（P<0.001）。进一步将487位点突变为甲硫氨酸（Met）可产生更强包装效应，证实该位点疏水性改变直接影响病毒粒子形成。在DEF细胞和BHK-21细胞中的生长曲线显示，V487A突变体复制动力学显著增强，24小时病毒产量比野生型高1个对数级。

神经炎症反应与病理损伤关联
感染高毒力毒株的小鼠脑组织呈现典型病毒性脑炎病理特征：神经元变性坏死（绿色箭头标记）、胶质细胞增生（蓝色箭头）和中性粒细胞浸润（黑色箭头）。qPCR检测显示，CHN-YC和CQW1-7M感染组促炎因子（IFN-γ、IL-6、TNF-α）表达量较对照组上调50-100倍，基质金属蛋白酶（Mmp3）表达升高与血脑屏障破坏相关。值得注意的是，NS1-T112M突变体虽在体外复制正常，却表现出显著毒力衰减，提示NS1蛋白可能通过免疫调节途径影响致病过程。

公共卫生意义与进化启示
该研究首次阐明TMUV E蛋白跨膜区自然突变如何通过物理化学特性改变（疏水性降低）增强病毒适应性。鉴于TMUV在东南亚养鸭场工人中血清阳性率达15%-30%，且最新发现的Cluster 3毒株可通过鼻内感染致死ICR小鼠，E-V487A等关键位点的监测将为评估禽源黄病毒跨种传播风险提供分子标记。研究采用的"进化逆向工程"策略（将现代毒株恢复为祖先基因型）为解析病毒表型进化提供了范式。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，未添加非文献记载内容；专业术语如TCID₅₀、i.c.等均按原文格式保留；去除了文献引用标识[#B1]等及图表索引[Fig 1]）