禽流感病毒H5N6与宿主核孔蛋白NUP93互作机制揭示：PB1结合促进病毒复制的关键路径

本研究通过亲和纯化质谱技术系统鉴定了H5N6禽流感病毒（AIV）聚合酶复合体（PB1/PB2/PA/NP）与鸡DF-1细胞的455种互作蛋白，发现核孔蛋白NUP93通过结合病毒PB1蛋白显著增强聚合酶转录活性，促进病毒复制。研究首次绘制了H5N6特异性宿主互作网络，筛选出9个促病毒基因（如NUP93、UBE2N）和20个抑病毒基因（如DDX3X），为阻断禽流感跨物种传播提供新靶点。

　　

病毒聚合酶-宿主互作分析揭示H5N6禽流感病毒复制机制

摘要

高致病性H5N6禽流感病毒（AIV）对家禽养殖和公共卫生构成重大威胁。研究团队利用亲和纯化质谱（AP-MS）技术，在鸡胚成纤维细胞（DF-1）中鉴定出455种与H5N6-JX株聚合酶复合体（PB1/PB2/PA/NP）互作的宿主蛋白，成功克隆231个基因。过表达实验发现9个宿主基因（如NUP93、UBE2N）显著促进病毒增殖，20个基因（如DDX3X、HNRNPH3）具有抑制作用。特别值得注意的是，核孔蛋白NUP93与病毒PB1直接结合，通过增强聚合酶转录活性促进病毒复制。这项研究为理解H5N6 AIV劫持宿主细胞的分子机制提供了新视角。

材料与方法

实验采用H5N6-JX病毒株感染DF-1细胞，通过HA标签免疫沉淀结合液相色谱-质谱（LC-MS/MS）鉴定互作蛋白。利用pCMV-3xFlag载体构建宿主基因过表达系统，通过流式细胞术检测H5N6-GFP报告病毒的复制效率。微型基因组实验评估宿主基因对病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）活性的影响，TCID₅₀法测定病毒滴度。共聚焦显微镜观察NUP93与PB1的共定位，截短体实验确定互作关键区域（aa 183-579）。

结果

1. 病毒RNP复合体互作宿主蛋白的鉴定
免疫沉淀质谱分析揭示PB2互作蛋白最多（215种），其次是NP（151种）和PB1（59种）。STRING分析显示这些蛋白形成复杂网络，涉及核糖体（RPL17/RPS29）、剪接体等通路。与H5N1和H1N1数据集比对发现34个新型互作因子。

2. 功能富集分析
GO分析显示宿主蛋白显著富集于肽代谢（P=1.2×10^-15）、肌动蛋白结合（P=3.4×10^-7）等过程。KEGG通路中核质转运（P=0.002）和基础转录因子（P=0.005）尤为突出，提示病毒劫持宿主基因表达机制。

3. NUP93的促病毒功能验证
过表达禽源NUP93使H5N6病毒滴度提升3.2倍（24 hpi），NP蛋白表达量增加2.8倍。siRNA敲低NUP93后，H7N9-GX的TCID₅₀下降至对照组的31%。有趣的是，病毒感染导致宿主NUP93 mRNA水平下调60%，形成负反馈调节。

4. PB1-NUP93互作机制
共免疫沉淀证实NUP93中段（aa 183-579）为PB1结合域。该区域过表达使微型基因组荧光素酶活性提升2.3倍，且不影响RNP组分表达。共定位实验显示两者在细胞质中存在共分布，暗示互作可能发生在病毒RNP核转运过程中。

讨论

该研究首次系统绘制H5N6特异性宿主互作图谱，发现NUP93通过"on-pore"核孔复合体（NPC）功能协助病毒复制。与人类NUP93不同，禽源同源蛋白主要增强聚合酶活性而非核输出。抑制性宿主因子如DEAD-box解旋酶DDX3X通过激活NLRP3炎症小体抑制病毒，这为开发广谱抗AIV药物提供了新思路。未来研究可聚焦核糖体蛋白（如RPL14）在病毒mRNA翻译中的具体作用机制。

重要性

这项工作不仅揭示了H5N6 AIV利用宿主核孔系统的新策略，还鉴定出29个调控病毒复制的关键基因。特别是NUP93-PB1互作界面的发现，为设计阻断禽流感跨物种传播的小分子抑制剂提供了精确靶点。