基于Langat病毒反向遗传学平台的减毒型蜱传脑炎疫苗开发研究

本研究针对现有灭活TBE疫苗需多次加强免疫的局限性，利用反向遗传学技术构建了四种Langat病毒(LGTV)感染性克隆(ICs)，其中DNA法构建的LGTVDNA+L-2000展现出优异的遗传稳定性、体外复制能力和小鼠免疫原性，为开发单剂次终身免疫的减毒TBE疫苗提供了关键技术平台。

　　

蜱传脑炎(TBE)是由蜱传脑炎病毒(TBEV)引起的严重神经系统疾病，在欧洲和亚洲发病率持续上升。现有灭活疫苗虽有效但需定期加强接种，且对老年人保护力有限。相比之下，减毒活疫苗可模拟自然感染诱导持久免疫，但历史上LGTV TP21疫苗因神经毒性被停用。这促使研究人员探索更安全的减毒策略。

瑞典厄勒布鲁大学的研究团队通过RNA和DNA两种反向遗传学方法，成功构建了四种LGTV感染性克隆。DNA法构建的LGTV_DNA+L-2000在Vero E6细胞中表现出最优的遗传稳定性，测序显示其与GenBank参考序列相似度最高。体外实验证实该毒株复制能力略低于实验室传代株(LGTV_Lab)，但细胞毒性显著降低(p<0.01)，且病毒颗粒组装缺陷更少。小鼠实验显示，LGTV_DNA+L-2000能诱导与LGTV_Lab相当的交叉反应性TBEV抗体水平，虽出现短暂体重下降但无严重不良反应。该研究发表于《npj Viruses》，为开发新型减毒TBE疫苗奠定了重要基础。

关键技术包括：1)RNA法使用SP6启动子体外转录全长LGTV RNA；2)DNA法采用四段重叠PCR片段通过CMV启动子在哺乳动物细胞中重组；3)下一代测序(NGS)分析病毒准种；4)基于Vero E6/A549细胞的生长动力学和细胞毒性评估；5)C57BL/6J小鼠模型免疫原性测试。

遗传差异分析
通过Sanger测序发现实验室传代株LGTV_Lab存在10个核苷酸突变，其中6个导致氨基酸改变，包括E蛋白D133G和H718Y等重要位点。

感染性克隆拯救
成功构建四种克隆：LGTV_RNA+L-Max、LGTV_RNA+L-2000、LGTV_DNA+L-2000和LGTV_DNA+Amaxa。DNA法产物病毒滴度更高，LGTV_DNA+L-2000在7天时产量最优。

遗传稳定性
NGS显示DNA法构建的克隆在传代5次后SNV(单核苷酸变异)分数总和更低，其中LGTV_DNA+L-2000最接近参考序列。值得注意的是，实验室株中的H718Y和D3202N突变在所有克隆传代过程中比例逐渐升高，提示这些是体外培养适应性突变。

体外特征
LGTV_DNA+L-2000在Vero细胞中表现出更高的特异性感染性(RNA/FFU比值更低)，病毒滴度峰值比LGTV_Lab早24小时出现。A549细胞产生更多缺陷病毒颗粒，可能与I型干扰素产生有关。

体内特征
5×10⁵ FFU肌肉注射后，LGTV_DNA+L-2000组小鼠第2天体重显著下降(p<0.05)，但21天后抗体水平与LGTV_Lab相当。病毒血症动力学显示两者均在48小时达峰，但LGTV_DNA+L-2000载量更低。

该研究首次建立了LGTV TP21株的反向遗传学系统，证实DNA法构建的克隆更适合疫苗开发。LGTV_DNA+L-2000展现出理想的减毒特征：保留免疫原性同时降低复制能力和细胞毒性。未来可通过靶向突变NS3/NS5蛋白或3'NCR(非编码区)进一步优化，解决历史上LGTV疫苗神经毒性的问题。这项工作为开发单剂次终身保护的TBE疫苗提供了关键技术平台，对应对欧洲和亚洲日益严峻的TBE流行具有重要意义。