跨平台DIA质谱技术构建人类角膜上皮细胞全面蛋白质组图谱揭示眼部疾病新靶点

本研究针对人类角膜上皮细胞(HCECs)蛋白质组数据匮乏的现状，采用Sciex ZenoTOF 7600、Bruker TimsTOF Pro2和ThermoFisher Orbitrap Fusion Lumos三平台数据非依赖采集(DIA)技术，结合Spectronaut和DIA-NN双软件分析，构建了包含11,954个蛋白质组(1% FDR)的迄今最全面角膜上皮蛋白质组数据集(PXD059451)，为干眼症、圆锥角膜等眼表疾病机制研究提供重要分子资源。

　　

论文解读

作为眼球最外层的防护屏障，角膜上皮细胞(HCECs)时刻抵御着外界病原体和机械刺激。然而这个仅有5-7层细胞厚度的精密结构，其蛋白质组成却长期笼罩在迷雾中。传统研究受限于样本稀缺和技术瓶颈，角膜蛋白质组数据量始终徘徊在3000种以下，更糟的是，依赖数据依赖采集(DDA)的方法存在严重偏向性——就像只捕捞海面的鱼群，那些可能承载疾病奥秘的低丰度蛋白往往从科研人员的"渔网"中溜走。这种数据缺口直接制约着干眼症、圆锥角膜等眼表疾病的机制解析，使得新型靶向药物的开发举步维艰。

香港理工大学与香港科学园眼视光研究中心的Kenrick Kai-yuen Chan、Jimmy Ka-wai Cheung及Thomas Chuen Lam团队决心打破这一僵局。他们巧妙运用三种尖端质谱仪的协同优势：ZenoTOF 7600的微流液相色谱与Zeno离子阱能捕获"深水区"蛋白，TimsTOF Pro2的四维离子淌度分离技术好比分子"指纹识别仪"，而Orbitrap Fusion Lumos的高分辨率扫描则提供了蛋白质的"高清特写"。配合机器学习驱动的Spectronaut和DIA-NN软件，研究团队成功绘制出包含11,954个蛋白质组的角膜上皮全景图谱，较既往最大数据集扩容4倍，相关成果发表于《Scientific Data》。

关键技术方法包括：使用永生化HCECs细胞系(BNCC337876)在标准条件下培养至第6代；采用EasyPep试剂盒完成蛋白质提取与胰蛋白酶/Lys-C双酶切；三台质谱仪分别运行DIA-SWATH、DIA-PASEF和DIA-HRMS1采集模式；通过0.1%甲酸-乙腈梯度洗脱系统实现肽段分离；最后用双软件进行1%假阳性率(FDR)控制的库非依赖分析。

研究结果
技术验证
跨平台验证显示93.1%的蛋白质组在所有生物学和技术重复中稳定检出，蛋白组水平的变异系数(CV)控制在12%以下。特别值得注意的是，24.2%的核心蛋白组被所有质谱-软件组合一致识别，而单肽段鉴定的蛋白比例经交叉验证后降至0.08%，显著提升了数据可靠性。

结构蛋白覆盖
该数据集完整收录了角膜特征性结构蛋白：28种角蛋白(Cytokeratins)构成细胞骨架网络，9种层粘连蛋白(Laminins)和22种整合素(Integrins)组成基底膜"锚定系统"，15种胶原蛋白(Collagens)与纤维聚合蛋白(Filaggrin)共同维护组织韧性。这些"分子身份证"的准确匹配证实了数据集的生物学相关性。

技术性能比较
TimsTOF Pro2以平均8,223个蛋白组的识别量领先，Orbitrap和ZenoTOF分别检出5,935和4,740个。引人注目的是，三平台联用使总识别量激增185%，且ZenoTOF在单位时间内检测效率最高，15分钟梯度洗脱即可完成4,740个蛋白组的定量。

结论与意义
这项研究犹如为角膜生物学研究装配了"蛋白质显微镜"，其突破性体现在三个维度：技术上，首次实现DIA-SWATH、DIA-PASEF和DIA-HRMS1技术的协同应用，证明多平台整合可有效克服单一仪器的检测盲区；数据上，11,954个蛋白组的规模不仅刷新纪录，更填补了66.4%的既往数据缺口；应用层面，该资源为解析角膜疾病分子机制提供了全新坐标——例如在干眼症中可能异常的粘附分子(Vitronectin)或圆锥角膜相关的基质金属蛋白酶，现在都有了完整的基线参照。

正如电子元件需要电路图才能维修，角膜疾病的精准诊疗也离不开完整的蛋白质"布线图"。这项研究提供的开源数据集(PXD059451)，将加速从"观察病理现象"到"解析分子电路"的范式转变，为开发针对角膜上皮屏障功能障碍的靶向疗法铺就了基石。当未来科学家试图修复角膜的"分子短路"时，这份图谱将成为不可或缺的导航仪。