酵母mRNA富集策略的比较分析与效率提升指南

本研究针对核糖体RNA(rRNA)污染严重影响真核生物转录组分析的难题，系统评估了酿酒酵母mRNA富集的两种策略：poly(A)尾捕获与rRNA靶向去除。团队通过优化oligo(dT)25磁珠与RNA比例、开发两轮富集方案，将rRNA含量降至10%以下，并证实SHAPE试剂NAI修饰不影响流程。该研究为转录组和RNA结构研究提供了高性价比的优化方案。

　　

在生命科学研究中，核糖体RNA(rRNA)就像一位过分热情的"话痨"——虽然它占真核生物总RNA的70-85%，却严重干扰科学家们聆听其他RNA分子的"声音"。尤其在酿酒酵母中，rRNA占比高达80%，而真正携带遗传信息的mRNA仅占5%。这种压倒性的存在导致高通量测序(NGS)时，宝贵的测序资源被rRNA大量占用，不仅降低基因表达分析的灵敏度，更阻碍了SHAPE-seq等RNA结构探测技术的准确性。

面对这一挑战，波兰科学院生物有机化学研究所RNA结构与功能系的Angelika Andrzejewska-Romanowska团队在《Scientific Reports》发表重要研究。他们系统比较了两种主流mRNA富集策略：基于poly(A)尾捕获的oligo(dT)磁珠法，以及靶向去除rRNA的RiboMinus试剂盒。令人惊讶的是，在厂商推荐条件下，单轮富集后rRNA残留仍高达50%。研究人员随后展开深度优化：通过调整磁珠与RNA比例，发现将oligo(dT)²⁵磁珠比例提升至125:1时，rRNA可降至20%；更突破性的是开发两轮富集方案，特别是1:1与13.3:1比例组合，使rRNA残留突破性降至8-12%。

关键技术方面，研究采用酵母BY4741菌株培养获取总RNA，通过毛细管电泳(TapeStation)和NGS双重验证富集效率。特别创新的是将DNA酶处理置于两轮富集之间，既降低成本又提升纯度。对于RNA结构研究至关重要的SHAPE化学探测，证实100-200 mM NAI(2-甲基烟酸咪唑啉)修饰完全兼容优化流程。

具体研究结果揭示：
优化mRNA富集：单轮不足
比较三种商业试剂发现，单轮处理均残留约50% rRNA，其中RiboMinus对18S rRNA去除更显著，而poly(A)选择法对25S rRNA效果略优。

磁珠与RNA比例优化
降低oligo(dT)²⁵磁珠比例至1:1几乎不影响效率，而提升至125:1可使rRNA降至20%，但成本效益不高。

两轮富集显著提升效率
创新性两轮方案使rRNA残留降至8-12%，其中1:1与13.3:1组合最优。相较单轮高比例方案，可节省75%磁珠用量。

NAI处理不影响富集效率
SHAPE试剂NAI修饰后，两轮富集仍保持高效，且DNase后处理进一步降低rRNA至6.9%，证实该方法完全适配RNA结构研究。

讨论部分强调，该方案突破性地解决了rRNA"淹没效应"：一方面，两轮oligo(dT)²⁵磁珠法成为最经济高效的选择（成本可低至0.05美元/10μg RNA）；另一方面，毛细管电泳被验证为替代NGS的快速质控手段。研究还揭示了酵母rRNA可能存在poly(A)化现象，这解释了为何靶向去除与poly(A)选择都难以完全清除rRNA。这些发现不仅为酵母转录组研究设立新标准，更对HEK293等人源细胞研究具有重要参考价值，特别是为SHAPE-MaP等需要超高测序深度的RNA结构研究扫清了技术障碍。