RNA结合蛋白DND1与NANOS3协同抑制人类生殖细胞谱系进入的分子机制研究

本研究揭示了RNA结合蛋白DND1与NANOS3在人类原始生殖细胞(hPGC)命运决定中的关键作用。研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑、iTRIBE技术等手段，发现DND1-NANOS3复合体通过结合SOX4 mRNA并在加工小体(P-bodies)中与4E-T-CNOT1复合物相互作用，抑制SOX4翻译从而限制hPGCLC的诱导。该发现为理解人类生殖细胞发育的转录后调控机制提供了新视角，对生殖相关疾病如不孕症和生殖细胞肿瘤的研究具有重要意义。

　　

在生命繁衍的奥秘中，生殖细胞的起源和发育一直是发育生物学研究的核心问题。原始生殖细胞(PGCs)作为精子和卵子的前体细胞，肩负着遗传信息代际传递的重任。然而，人类PGC(hPGC)命运决定的调控机制仍存在大量未知，特别是在转录后调控层面。传统上，小鼠模型为理解生殖细胞发育提供了重要线索，但近年研究发现人类与小鼠在关键调控因子如PRDM14和SOX2的作用上存在显著差异，凸显了直接研究人类生殖细胞发育机制的必要性。

RNA结合蛋白(RBPs)作为转录后调控的主要执行者，在生殖细胞发育中扮演重要角色。其中，DND1(Dead end1)和NANOS3是两种进化保守的生殖细胞特异性RBP，在模式生物中的研究表明它们对生殖细胞的迁移、存活和分化至关重要。然而，这些蛋白在人类生殖细胞命运决定中的具体功能和分子机制尚不清楚。此外，DND1基因突变与非梗阻性无精症相关，NANOS3突变则与卵巢早衰有关，提示它们在人类生殖健康中的重要性。但关键的科学问题仍然存在：这些RBP如何协同调控人类生殖细胞的命运决定？它们的下游靶标和分子通路是什么？

为回答这些问题，浙江大学医学院的研究团队在《Nature Communications》发表了最新研究成果。研究人员采用多学科交叉的方法，结合基因编辑、转录组学、蛋白质互作分析和先进的RNA标记技术，系统解析了DND1-NANOS3复合物在人类胚胎干细胞(hESC)向hPGC样细胞(hPGCLC)诱导过程中的调控机制。

关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9构建DND1和NANOS3敲除的hESC系；建立可诱导的hPGCLC体外诱导系统；应用iTRIBE和Bullseye技术鉴定RBP的RNA靶标；通过免疫共沉淀和荧光显微镜分析蛋白互作与亚细胞定位；采用MS2-MCP系统追踪特定mRNA的时空动态。研究使用的hESC系包括H1(46,XY)、H9(46,XX)和HN4(46,XX)。

研究结果部分：

DND1限制从人类胚胎干细胞诱导原始生殖细胞的产生
通过CRISPR/Cas9技术构建DND1敲除(D1-KO)hESC系，发现D1缺失显著增加hPGCLC的诱导效率，而D1过表达则抑制hPGCLC形成。EdU掺入实验排除了增殖差异的影响，RNA-seq分析证实D1-KO不改变hPGCLC的细胞命运。这些结果表明DND1在人类系统中发挥与小鼠模型不同的功能，特异性抑制生殖细胞命运的进入。

NANOS3与DND1协同抑制hPGCLC的诱导
类似地，NANOS3敲除(N3-KO)也增加hPGCLC产量，而过表达抑制其形成。共免疫沉淀证实DND1与NANOS3形成RNA非依赖性的复合物。双敲除实验显示二者在功能上协同作用，共同构成限制生殖细胞命运的"刹车系统"。

鉴定DND1和NANOS3在hPGCLC中结合的mRNA
采用iTRIBE技术捕捉DND1和NANOS3的RNA靶标，发现二者共同结合746个mRNA，这些靶标富集于Wnt信号通路等与生殖发育相关的通路。特别值得注意的是，SOX4 mRNA被鉴定为关键的下游靶标。

DND1促进NANOS3结合hPGCLC相关靶标mRNA
通过Bullseye技术分析显示，DND1显著改变NANOS3的RNA结合特异性，使其从独立靶标转向hPGCLC相关mRNA。在hESC中过表达DND1可使NANOS3获得类似hPGCLC中的结合特征，表明DND1引导NANOS3识别生殖细胞发育相关的mRNA。

鉴定SOX4作为DND1-N3调控hPGCLC诱导的关键靶基因
CRISPRi介导的SOX4敲低可逆转D1-KO和N3-KO表型。虽然SOX4 mRNA水平不变，但其蛋白水平在敲除系中显著升高，在过表达系中降低，表明DND1-N3复合物在翻译水平调控SOX4表达。

DND1-N3复合物在P小体中抑制SOX4 mRNA的翻译
亚细胞定位研究发现DND1定位于加工小体(P-bodies)，并能将NANOS3招募至此。MS2-MCP系统证实SOX4 mRNA也被富集在P-bodies中。机制上，DND1通过与翻译抑制因子4E-T和CNOT1的互作来抑制SOX4翻译，这一过程依赖NANOS3的桥梁作用。当用环己酰亚胺破坏P-bodies时，DND1-N3对SOX4的翻译抑制被解除。

这项研究首次揭示了DND1-NANOS3复合物作为人类生殖细胞命运决定的"刹车系统"的分子机制。与小鼠模型不同，人类DND1表现出抑制而非促进生殖细胞发育的功能，这种物种特异性差异为理解人类生殖生物学提供了新视角。研究发现该复合物通过独特的"分工合作"模式：DND1负责将NANOS3引导至生殖细胞相关的mRNA(如SOX4)，而NANOS3则介导与4E-T-CNOT1翻译抑制复合物的相互作用，最终在P-bodies中实现对靶标mRNA翻译的抑制。

该研究的科学意义主要体现在三个方面：首先，阐明了人类生殖细胞命运决定中一个关键的转录后调控机制，填补了该领域的知识空白；其次，发现的DND1-NANOS3-SOX4调控轴为理解生殖相关疾病如不孕症、卵巢早衰和生殖细胞肿瘤的发病机制提供了新线索；最后，研究揭示的P-bodies在细胞命运决定中的调控作用，为细胞分化研究开辟了新思路。这些发现不仅深化了对人类生殖生物学基础理论的认识，也为相关生殖疾病的诊断和治疗提供了潜在的分子靶点。