增强慢病毒载体介导的体内肝细胞基因治疗效力的创新策略

研究人员针对单基因疾病治疗中慢病毒载体(LV)肝靶向效率不足的问题，通过"后验增强"(a posteriori)和"先验增强"(a priori)双路径策略，开发出包括蛋白酶体抑制、I型干扰素信号阻断和禁食方案在内的组合方案，使转基因表达量提升40倍，同时证实选择性扩增的肝细胞未出现致癌基因附近整合位点富集，为临床转化提供了安全高效的解决方案。

　　

肝脏作为重要的代谢和合成器官，其功能异常会导致血友病等众多单基因遗传病。虽然腺相关病毒(AAV)载体在肝靶向基因治疗中取得进展，但其局限性日益凸显：AAV载体基因组随肝细胞增殖逐渐稀释，难以用于儿童患者；且人类普遍存在抗AAV抗体。相比之下，慢病毒载体(LV)能稳定整合基因组，适合长期治疗，但转导效率不足制约其临床应用。如何在不增加剂量前提下提升LV效力，成为领域内亟待解决的关键问题。

来自意大利San Raffaele科学研究所的Cesare Canepari团队在《Nature Communications》发表研究，通过多维度策略显著提升LV肝靶向效率。研究采用双管齐下的方案：一方面通过靶向NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(Cypor)的shRNA赋予转导肝细胞对乙酰氨基酚的选择性优势（后验增强）；另一方面开发包括蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)、抗IFNAR1抗体和禁食方案在内的组合策略（先验增强）。关键技术包括：使用VSV.G假型LV载体、流式分选肝细胞亚群、液滴数字PCR(ddPCR)定量载体拷贝数(VCN)、SLiM-PCR整合位点分析等。

克隆扩增的LV转导肝细胞可渐进性增加转基因输出
通过携带抗Cypor shRNA的LV处理血友病小鼠，经周期性乙酰氨基酚给药实现转导肝细胞选择性扩增。在成年野生型小鼠中，FIX表达量提升达50倍；新生血友病A小鼠FVIII水平从亚治疗级(3%)升至治疗级(25%)。整合位点分析显示，尽管存在克隆扩增，但致癌基因附近整合位点未见富集，Shannon多样性指数证实选择组克隆多样性降低。

瞬时蛋白酶体或I型干扰素抑制增强LV效力
硼替佐米预处理使血友病B小鼠FIX表达提升2倍，血友病A小鼠FVIII提升10-30倍。机制研究表明，硼替佐米通过降低库普弗细胞(KC)和浆细胞样树突细胞(pDC)的VCN，间接增加肝细胞转导；体外实验证实其可直接促进原代肝细胞转导。抗IFNAR1抗体预处理则使FVIII表达提升20-40倍，但联合硼替佐米未显示协同效应。

禁食方案显著改善LV基因治疗效力
24小时禁食使小鼠FIX表达提升3倍，通过LV-FIX IRES GFP载体证实转导肝区面积增加。机制研究发现禁食降低前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)水平和Ldlr表达，而Ldlr敲除小鼠转导效率提升2-3.5倍，提示LDLR通路在LV内化中起负调控作用。

组合策略与CD47^hi-LV产生协同效应
在NOD小鼠中，禁食联合硼替佐米预处理使CD47^hi-LV的FIX表达量产生惊人的40倍提升。这种"吞噬屏蔽"LV与转导增强剂的协同作用，为临床转化提供了最优方案。

该研究创新性地建立了可模块化组合的LV效力增强体系：后验增强策略适合需要渐进性疗效的疾病，而先验增强方案更适用于需快速起效的病例。特别值得注意的是，所有增强策略均采用已临床应用的药物（硼替佐米、Anifrolumab）或易实施的禁食方案，具有显著的转化医学价值。研究不仅为血友病治疗提供了新思路，更为需要高比例肝细胞校正的代谢性疾病开辟了道路，通过降低有效剂量减轻了病毒载体相关的免疫原性和生产成本压力，对推动基因治疗领域发展具有重要意义。