无连接链PROTACs高效诱导致癌蛋白降解：一种新型靶向蛋白降解策略

为解决传统蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)分子量大、连接链优化复杂等问题，研究人员开展了一项关于无连接链PROTACs的设计与应用研究。通过将单氨基酸降解信号直接偶联至靶蛋白配体，成功开发出高效降解EML4-ALK和BCR-ABL的小分子降解剂Pro-BA和Gly-DA。该研究证实无连接链设计可增强靶蛋白与E3泛素连接酶的相互作用，显著提高降解效率，并展示良好的口服生物利用度，为靶向蛋白降解(TPD)领域提供了新范式。

　　

在肿瘤治疗领域，靶向蛋白降解(TPD)技术通过利用细胞内泛素-蛋白酶体系统选择性清除致病蛋白，展现出巨大潜力。然而，传统蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)面临两大瓶颈：一是分子量普遍超过500 Da，违反类药五规则(Lipinski's rule of five)，影响口服生物利用度；二是连接链(linker)优化依赖试错法，耗时耗力且缺乏普适性设计原则。与此同时，分子胶(MGs)虽分子量小，但其发现过程具有随机性，难以系统化设计。这些限制严重阻碍了TPD技术的临床应用转化。

为突破这些限制，南方科技大学和深圳先进技术研究院的研究团队创新性地提出"无连接链PROTAC"设计策略。研究人员基于前期开发的单氨基酸降解信号(AATac)技术，直接将N端降解信号(N-degron)与靶蛋白配体共价连接，成功开发出系列分子量小于500 Da的高效降解剂。相关研究成果发表在《Nature Communications》上，为TPD领域提供了全新设计范式。

研究团队主要采用以下关键技术方法：1)基于结构设计将N端降解信号(Pro/Gly/Arg)直接偶联至靶蛋白配体；2)通过免疫印迹和定量蛋白质组学评估降解效率；3)利用等温滴定量热法(ITC)和NanoBRET技术分析三元复合物形成；4)建立异种移植瘤模型评估体内药效；5)采用药代动力学(PK)和药效学(PD)研究验证口服生物利用度。样本来源于非小细胞肺癌细胞系H3122(EML4-ALK阳性)和慢性髓系白血病细胞系K562(BCR-ABL阳性)。

设计及在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中的生物学评价
研究人员设计了三款无连接链PROTACs：Pro-BA、Gly-BA和Arg-BA，其中Pro-BA对EML4-ALK的降解半效浓度(DC₅₀)仅为74 nM，显著优于含PEG3连接链的对照化合物Pro-PEG3-BA(DC₅₀=416 nM)。定量蛋白质组学分析显示，Pro-BA能特异性降低EML4-ALK水平(>40倍)，且对全蛋白质组影响有限，证实其高度选择性。

Pro-BA在体外表现优于含连接链的Pro基PROTACs
直接比较显示，无连接链的Pro-BA在降解效率(DC₅₀)、最大降解程度(D_max)、诱导凋亡等方面均显著优于含1-3个PEG单元的对照化合物。溶解度测试表明Pro-BA水溶性达1.8×10⁶ μM，是Pro-PEG3-BA的200倍，且细胞膜通透性提高1.5倍，这为其优异体内表现奠定基础。

Pro-BA在体内展示更好的抗肿瘤效果
在H3122异种移植模型中，腹腔注射10 mg/kg Pro-BA的抑瘤效果显著优于等剂量Pro-PEG3-BA。口服给药时，Pro-BA表现出良好的药代动力学特征：半衰期(T_1/2)3.4 h，口服生物利用度35%。25 mg/kg剂量下可实现肿瘤显著消退，且未观察到明显毒性。

作用机制解析
研究发现Pro-BA通过CTLH E3连接酶复合物的底物受体GID4介导降解。敲除GID4可完全阻断Pro-BA的降解作用，但不影响Arg-BA或Gly-BA的活性。NanoBRET和免疫共沉淀证实，Pro-BA能更有效促进EML4-ALK与GID4的相互作用，增强泛素化修饰。ITC分析显示，无连接链设计使Pro-BA与ALK的结合亲和力(K_d=144 nM)比Pro-PEG3-BA(K_d=387 nM)提高近3倍。

策略普适性验证
将该设计应用于BCR-ABL靶点，开发的无连接链降解剂Pro-DA和Gly-DA在K562细胞中分别实现DC₅₀=8 nM和6 nM的极高活性。值得注意的是，Gly-DA的活性比含PEG1连接链的对照化合物提高40倍，再次验证无连接链设计的优势。

这项研究颠覆了"连接链是PROTACs必要组分"的传统认知，开创性地证明：1)单氨基酸降解信号可直接偶联靶蛋白配体，无需连接链即可形成高效降解剂；2)无连接链设计能增强靶蛋白-E3连接酶相互作用，提高泛素化效率；3)该策略可显著降低分子量(<500 Da)，改善类药性，且展示良好口服生物利用度。

从更广泛的视角看，该研究弥合了PROTACs与MGs的技术鸿沟：既保留了PROTACs模块化设计的优势，又兼具MGs分子量小的特点。通过利用保守的N端规则通路(N-end rule pathway)，该策略可扩展至19种氨基酸降解信号，为针对不同靶点和适应症的降解剂开发提供丰富工具箱。未来，通过优化氨基酸类型和靶向配体，这一平台技术有望推动更多高效、可口服的靶向降解药物进入临床，为癌症等重大疾病治疗提供新选择。