液态氮保存法突破牛奶RNA提取瓶颈：为乳腺转录组研究提供非侵入性解决方案

为解决传统冰保存法对牛奶RNA稳定性的影响及即时处理需求的问题，研究人员开展了一项关于液态氮保存法在牛奶样本收集中的应用研究。通过比较RNA质量、完整性和测序效果，发现液态氮保存的样本虽RNA完整性数值(RIN)较低，但RNA测序(RNA-seq)仍能获得高质量数据，成功解析乳腺上皮细胞转录组。该方法为非侵入性研究乳腺生理和泌乳机制提供了新思路，具有重要应用价值。

　　

乳腺是哺乳动物泌乳的核心器官，其功能研究对畜牧业和人类健康至关重要。然而，传统研究方法面临两大难题：一是乳腺活检具有侵入性，可能损伤组织且无法动态监测；二是现有非侵入性方法如牛奶体细胞采样，仅含少量乳腺上皮细胞，难以真实反映乳腺状态。更棘手的是，牛奶中富含核糖核酸酶(RNase)，常规冰保存法需在4小时内处理样本，极大限制了研究的灵活性和可重复性。

为解决这些瓶颈，来自西班牙纳瓦拉公立大学的研究团队创新性地将液态氮保存法引入牛奶样本采集，系统评估了该方法对RNA质量及后续转录组分析的影响。研究成果发表在《BMC Genomics》上，为乳腺研究提供了更优解决方案。

研究采用15头健康荷斯坦奶牛的新鲜牛奶样本，通过液态氮速冻后，从牛奶脂肪球(MFG)中提取RNA。关键技术包括：1)液态氮速冻保存样本；2)差速离心分离MFG；3)Trizol LS结合硅胶柱法提取RNA；4)Nanodrop、Qubit和TapeStation多平台评估RNA质量；5)Illumina NovaSeq进行双端150bp RNA测序(RNA-seq)。

RNA质量、完整性和定量评估
通过三种方法评估RNA质量发现：A_260/280比值(2.03±0.01)和完整性质量(IQ)值(9.51±0.15)均达标准，但RNA完整性数值(RIN)仅3.59±0.27，远低于常规阈值7。电泳图谱显示MFG的RNA以200nt小片段为主，18S/28S rRNA含量极低，证实低RIN值源于样本特性而非降解。RNA浓度虽较低(102-120 ng/μL)，但个体差异显著，可能与MFG大小差异有关。

RNA测序数据分析
尽管RIN值不理想，RNA-seq仍获得平均5270万条高质量双端读长，Q30碱基占比超92%，GC含量49%。数据清洗后99%读长保留，且成功定位到乳腺特异性基因如α-S1-酪蛋白(CSN1S1，86100 FPKM)和β-乳球蛋白(PAEP/BLG，67037 FPKM)，证实测序结果准确反映了MFG转录组特征。

方法学比较优势
与传统冰保存法相比，液态氮保存使样本可长期存放于-80°C，避免了4小时内处理的紧迫性。虽然MFG来源的RNA具有天然低RIN特性，但研究表明这并不影响RNA-seq效果，颠覆了"RIN≥7"的传统认知。

该研究确立了液态氮保存法在牛奶样本采集中的可靠性，突破了时间空间限制，使大规模乳腺转录组研究成为可能。从应用角度看，MFG作为乳腺上皮细胞的"分子快照"，为研究泌乳调控、乳腺健康及牛奶成分合成提供了非侵入性窗口。特别在畜牧领域，该方法可用于筛选优良泌乳性状的种牛，或监测乳腺炎等疾病状态。未来研究可进一步优化RNA提取效率，并探索该方法在其他哺乳动物中的应用潜力。

值得注意的是，研究也存在样本量较小(15头奶牛)和未直接比较冰保存法的局限。但作为首个系统评估液态氮保存效果的工作，其方法论创新为后续研究奠定了重要基础。正如作者Olaia Urrutia团队强调的，这项技术将显著提升乳腺生理学研究的可行性和动物福利水平。