机械振荡培养通过TEAD-Fbxl3-CRY轴抑制诱导多能干细胞成骨分化中的昼夜节律

为解决机械力如何影响iPSCs（诱导多能干细胞）成骨分化中的昼夜节律这一未知问题，研究人员通过对比静态贴壁与振荡培养，发现振荡条件通过激活YAP-TEAD转录级联上调Fbxl3，促进CRY蛋白降解，从而抑制核心时钟基因（Clock/Bmal1/Npas2）的振荡；使用YAP-TEAD抑制剂Verteporfin可恢复节律并促进成骨标记物表达。该研究揭示了生物力学信号与昼夜调控的新机制，为再生医学中的组织工程优化提供了理论依据。

　　

论文解读

研究背景与问题
昼夜节律是生物体适应地球24小时光暗循环的核心机制，由Clock、Bmal1等核心时钟基因构成的转录-翻译反馈环调控。近年研究发现，昼夜节律不仅影响代谢和生理过程，还与成骨分化密切相关。然而，在组织工程中广泛应用的机械力培养（如振荡培养）如何影响iPSCs（诱导多能干细胞）成骨分化时的昼夜节律，仍是一个未解之谜。这一问题对优化骨类器官构建策略至关重要，因为机械力可能通过改变细胞间接触或力学感受器信号干扰细胞内节律，进而影响分化效率。

研究设计与方法
日本东北大学的研究团队通过对比小鼠iPSCs在静态贴壁与振荡培养中的表现，结合多组学分析，揭示了机械力调控昼夜节律的分子机制。研究首先通过实时定量PCR（RT-PCR）监测Clock、Bmal1和Npas2的振荡表达；利用RNA-seq和ATAC-seq（染色质可及性测序）筛选差异基因与通路；通过染色质免疫共沉淀（ChIP）验证TEAD与Fbxl3启动子的结合；最后使用YAP-TEAD抑制剂Verteporfin（VP）和蛋白酶体抑制剂MG132进行功能挽救实验。

研究结果

1. 振荡培养减弱时钟基因的节律性表达
静态培养中，iPSCs-EBs（胚胎样体）在成骨诱导2-30天内均表现出Clock、Bmal1和Npas2的显著振荡（P<0.05，稳健性>50%），而振荡培养组节律性持续衰减（P>0.05，稳健性<50%）。

2. YAP-TEAD转录级联是关键调控者
RNA-seq发现振荡培养中Hippo通路效应子YAP（Yes-associated protein）核转位增加，激活TEAD（转录增强关联域）介导的转录。ATAC-seq显示TEAD2结合基序在振荡组富集，ChIP-qPCR证实TEAD直接结合Fbxl3（F-box only蛋白13）启动子，促进其表达。

3. TEAD-Fbxl3-CRY轴破坏节律反馈环
Fbxl3上调通过泛素-蛋白酶体途径加速CRY（隐花色素）蛋白降解，从而抑制Clock/Bmal1复合物的负反馈调控。VP处理或MG132抑制蛋白酶体均可恢复CRY水平与时钟基因振荡。

4. 抑制YAP-TEAD促进成骨分化
VP处理的振荡培养组成骨标记物（Runx2、Ocn、Col1a1）表达显著升高，组织学显示更厚的骨样基质层和更多钙化结节，表明节律恢复可优化成骨分化。

结论与意义
该研究首次阐明机械力通过TEAD-Fbxl3-CRY轴干扰iPSCs成骨分化中的昼夜节律，提出YAP-TEAD抑制剂可作为改善节律相关成骨缺陷的潜在策略。这一发现不仅拓展了生物力学-节律调控的理论框架，还为再生医学中骨类器官的标准化培养提供了新思路。论文发表于《Cell Death Discovery》，为组织工程与昼夜生物学的交叉研究树立了范例。