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本综述聚焦艰难梭菌感染（CDI）实验室诊断，介绍现有方法分类（毒素检测、细菌检测、产毒菌株检测），推荐欧洲临床微生物和传染病学会（ESCMID）两步法诊断策略，分析诊断误区并展望新技术，助力提升 CDI 诊断准确性与临床管理水平。
艰难梭菌感染的实验室诊断：现状与进展
病原体与流行病学特征
艰难梭菌（Clostridioides difficile）为革兰氏阳性产芽孢厌氧肠道致病菌，其毒力主要源于毒素 A（TcdA）和毒素 B（TcdB），部分菌株可产生二元毒素。产毒菌株感染可引发从轻度腹泻到假膜性结肠炎、中毒性巨结肠等一系列疾病，是医疗相关腹泻的主要病因。近年来，社区获得性 CDI 报告逐渐增多。
2000 年代初，PCR 核糖体分型（RT）027 克隆株引发欧美大规模严重 CDI 暴发，虽随后因 “高毒力” 菌株减少、抗菌药物管理及感染控制措施普及，欧美发病率有所下降，但 CDI 仍是重要公共卫生问题。在法国，艰难梭菌是全科医生接诊胃肠道疾病患者中分离率第二的肠道病原体，仅次于弯曲杆菌属。
诊断现状与关键挑战
CDI 诊断依赖实验室检测、临床评估及必要的影像学或内镜检查。欧洲 COMBACTE-CDI 研究显示，2018 年欧洲住院患者中 16% 的 CDI 未被诊断，社区获得性 CDI 因临床怀疑不足漏诊率更高，导致疾病真实负担被低估。
标本采集与处理要点
- 样本类型：仅腹泻粪便（布里斯托量表 5-7 型）适合检测，以减少无症状携带产毒菌株导致的假阳性。直肠或肛周拭子不适用于游离毒素检测，但可用于肠梗阻或中毒性巨结肠患者的细菌培养或分子检测。
- 特殊人群：2 岁以下住院患儿无症状携带率高（20%-70%），检测需经儿科医生和临床微生物学家会诊，仅限特定病例（如暴发、先天性巨结肠等）。
- 时机与保存：标本应在治疗前采集，避免经验性治疗导致假阴性。粪便需在采集当日检测，若不能及时检测，4°C 可保存最多 3 天，之后需 - 80°C 冷冻，-20°C 保存或反复冻融会影响毒素效价。使用粪便转运培养基的拭子样本因稀释效应灵敏度较低，不可替代粪便样本用于两步法诊断。
诊断方法分类与评价
目前诊断方法按检测靶点分为三类：
检测艰难梭菌（非产毒菌株）
- 谷氨酸脱氢酶（GDH）检测：GDH 是艰难梭菌特异性代谢酶，检测方法包括 ELISA 和免疫层析法，阴性预测值高，可作为筛查试验，但阳性结果不能区分产毒与否，需进一步毒素检测确认。
- 细菌培养：使用选择性培养基（如 CCFA）或显色培养基，培养需 48 小时厌氧孵育，菌落具特征性气味。培养可用于抗生素敏感性测定和菌株分型，但无法直接判断产毒状态，且耗时较长。
检测游离毒素
- 细胞毒性中和试验（CCNA）：通过粪便滤液对细胞培养的细胞病变效应及抗毒素中和反应判断，是检测游离毒素的金标准之一，但技术复杂、周转时间长，仅限参考实验室使用。
- 酶免疫测定（EIA）：检测毒素 A/B，操作简便、30 分钟内出结果，但灵敏度差异大（29%-86%），不能单独用于诊断。
检测产毒菌株
- 核酸扩增试验（NAAT）：基于实时 PCR 或环介导等温扩增技术，检测毒素基因（tcdA/B）及二元毒素基因等，灵敏度超 90%，数小时内出结果，但可能因检测到无症状携带的产毒菌株导致过度诊断。细菌负荷（CT 值）可辅助预测毒素存在，CT 值≤25.3 时预测毒素 EIA 结果的准确率约 80%。
- 产毒培养：验证分离菌株体外产毒能力，是鉴定产毒菌株的参考方法，但因耗时久不用于常规检测。
推荐诊断策略：两步法算法
欧洲临床微生物和传染病学会（ESCMID）推荐两步法诊断流程：
- 第一步：敏感筛查试验：采用 NAAT 或 GDH EIA，阴性结果可排除 CDI。
- 第二步：特异性确认试验：筛查阳性时，使用毒素 A/B EIA 等检测游离毒素。
- 替代方案：使用同时检测 GDH 和游离毒素的免疫层析装置，双阴性排除 CDI，双阳性支持诊断，毒素阳性 / GDH 阴性需重新检测。
- 特殊情况：GDH 阳性 / 毒素阴性可能为非产毒菌株或毒素低于检测阈值，需结合 NAAT 及临床评估（如病程、危险因素等）区分感染与定植。研究显示，NAAT+/ 毒素 + 患者复发率（19.8%）显著高于 NAAT+/ 毒素 - 患者（11%），且后者未治疗者死亡率更高，提示部分 NAAT+/ 毒素 - 患者可能需治疗。
美国感染病学会（IDSA）指南与 ESCMID 一致，允许在严格执行标本筛选时单独使用 NAAT。
诊断误区与新型技术
常见诊断陷阱
- 显色培养基局限性：如 RT023 菌株无法水解七叶苷，在 ChromId 琼脂上不形成黑色菌落，需注意非典型无色菌落的鉴定。
- 产毒菌株检测盲区：RT033 菌株缺乏完整tcdB基因、携带二元毒素基因，毒素 EIA 检测阴性，需通过检测二元毒素基因的 NAAT 识别。
- 核糖体分型误判：部分检测通过二元毒素基因和tcdC基因 117 位缺失预测 RT027，但其他分型（如 RT016、080 等）也可能携带相关标记，需通过基于毛细管电泳的 PCR 核糖体分型确认。
新技术展望
- 单分子检测（SiMoA）：通过抗体包被磁珠捕获毒素，结合酶底物反应和数字成像，可单独检测并定量毒素 A/B，检测下限约 1 pg/mL。Clarity C. diff毒素 A/B 检测在与三步法（Xpert+EIA+/-CCNA）对比中，灵敏度 97.7%、特异性 100%，有望替代多步检测流程。
- 炎症生物标志物：粪便乳铁蛋白和钙卫蛋白在 CDI 中升高，与毒素阳性患者相关性更强，但个体差异大，临界值难以确定。白细胞介素 - 1β（IL-1β）在 CDI 患者中显著高于其他组别，但仍需更多研究验证其诊断价值。
总结
CDI 诊断面临无症状携带与感染鉴别、检测方法局限性等挑战，两步法诊断策略结合敏感筛查与特异性毒素检测可提高准确性。未来，高灵敏度与特异性的单分子检测等新技术有望简化流程，而生物标志物的深入研究或为诊断提供新维度。临床实践中需重视标本合理选择、检测流程优化及新型菌株的识别，以提升 CDI 诊疗水平。
