TMB底物成分的系统性研究：提升ELISA检测信号强度的创新优化策略

为解决ELISA（酶联免疫吸附试验）中TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物信号强度与稳定性不足的问题，研究人员系统探究了缓冲液pH、离子组成、有机溶剂及聚合物稳定剂等关键参数，最终开发出含0.2 mol/L柠檬酸钠（pH 4.5）、5% DMSO（二甲基亚砜）及0.37 mmol/L CaCl2的优化配方，显著提升检测性能，为临床诊断提供更可靠的解决方案。

　　

在临床诊断、法医学和食品化学等领域，酶联免疫吸附试验（ELISA）因其高灵敏度和特异性成为不可或缺的分析工具。然而，作为其核心检测底物的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）虽已使用四十余年，其配方优化却长期缺乏系统性研究。现有商业TMB溶液性能参差不齐，且专利技术常隐瞒关键成分作用机制，阻碍了进一步改进。此外，游离辣根过氧化物酶（HRP）与固相结合HRP的最适反应条件差异未被充分探索，导致实际检测中信号强度与稳定性不足。

针对这些挑战，俄罗斯科学基金会资助的研究团队开展了一项系统性研究，旨在揭示TMB底物成分对ELISA信号的影响机制，并开发高性能配方。研究人员通过文献与专利分析，筛选出深共熔溶剂、离子液体等潜在增效策略，并实验验证了缓冲液pH、离子种类（如Ca²⁺）、有机溶剂（如DMSO）和环糊精衍生物（2-羟基-β-环糊精）的协同作用。最终优化的TMB溶液包含0.2 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）、5% DMSO、0.37 mmol/L CaCl₂、0.4 mmol/L 2-羟基-β-环糊精、0.8 mmol/L TMB和1.3 mmol/L H₂O₂，其性能显著优于传统配方和部分商业产品。该成果发表于《Analytical Biochemistry》，为ELISA技术的标准化与精准化提供了重要参考。

关键技术方法
研究采用直接ELISA模式，以生物素化牛血清白蛋白（Bi-BSA）和人IgG为模型分析物，使用商业HRP-链霉亲和素（HRP/Str）和实验室自制的HRP标记单抗（HRP/MAb）进行检测。通过微孔板固定抗原后，系统测试不同缓冲液体系、有机溶剂浓度及稳定剂组合对吸光度的影响，结合统计学分析确定最优参数。

研究结果

1. 材料筛选：俄罗斯产试剂（如DMSO、DMA）经纯度验证后用于实验，确保批次一致性。
2. 实验设计：通过对比HRP/Str和HRP/MAb在不同底物条件下的催化效率，发现Ca²⁺和环糊精可显著提升TMB氧化速率。
3. 结论：优化配方通过平衡底物溶解性与转化率，使信号强度提升2.3倍，且室温稳定性达48小时。
4. 竞争利益声明：作者声明无财务或个人利益冲突。
5. 数据共享：原始数据可根据请求提供。

重要意义
该研究首次系统阐明了TMB底物中各成分的协同作用机制，提出的优化方案不仅解决了传统配方信号弱、稳定性差的问题，还为开发新型HRP底物提供了理论框架。尤其值得注意的是，2-羟基-β-环糊精的引入通过分子包合作用延缓TMB降解，这一发现可拓展至其他氧化显色体系。研究强调，未来工作需进一步探索TMB类似物（如衍生物TM₂B）在复杂样本（如全血）中的适用性，以推动体外诊断技术的革新。