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该综述聚焦细胞外囊泡（EVs）的生物分子冠（BC），探讨其形成、组成及重要性，综述生物、化学和物理工程策略，及其在治疗中的应用，为提升 EVs 治疗效果及解决靶向、 cargo 富集等挑战提供思路。
1. 背景
细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中作用显著，可通过传递 DNA 片段、微小 RNA（miRs）、蛋白质和脂质等生物分子治疗多种疾病。过去认为提取 EVs 时伴随的白蛋白、脂蛋白等是污染物，现研究表明这些附着于 EVs 表面的 “冠” 分子会影响其特性和功能，如改变信号货物在体内的命运、影响治疗特性等。EVs 的生物分子冠（EV-BC）除蛋白质和蛋白复合物外，还包含脂质和核酸（RNA 甚至 DNA）。EVs 治疗面临靶向和货物富集等挑战，研究 BC 的形成、组合和功能有助于改善 EVs 治疗，对 EV 表面和 BC 进行工程化是解决这些问题的有效途径。
2. EV 生物分子冠（EV-BC）的形成和组成
合成纳米颗粒（NPs）的冠形成在物理和化学特性上可作为研究 EV 冠形成的合适模型，脂质体与 EVs 最为相似，其 BC 构建研究可在一定程度上弥补其他 NPs 在反映 EV-BC 形成生物学特性上的不足。EV-BC 在体内和体外条件下的形成有显著差异，PC 形成分为不同阶段，先形成不可逆的内硬 PC 层，再形成可逆的外软 PC 层。EV-PC 形成比纳米颗粒冠更复杂，涉及多种表面生物因素，EV 表面分子构成 BC 成分可分为两类，BC 分子通过物理和化学相互作用被伪 BC 吸收。EV-BC 的形成受 EV 外表面成分、分泌和导入环境成分及条件影响，病理条件也会影响其组成和性质。不同细胞来源的 EVs 的 BC 组成多样，除分泌细胞类型外，还与细胞来源的生理条件和生物发生过程有关，同时受性别、饮食习惯等多种因素影响。分子与 EV-BC 的相互作用涉及多种物理和化学键，EV-BC 相互作用组包含在任何环境和条件下可与 EV 表面相互作用的所有分子。EV-BC 的分离和表征方法多样，包括离心、尺寸排阻色谱、磁分离等分离方法，以及纳米颗粒跟踪分析、暗场显微镜、质谱等分析表征方法，人工智能等新技术也应用于 BC 研究。
3. EV 处理引起的生物分子冠（BC）变化
EV 提取方法和保存条件会影响 BC 的结构和组成，进而影响其功能和治疗效果。超离心和尺寸排阻色谱等提取方法会去除 EV-PC 中的部分蛋白质，剪切力会剥离 EVs 的软 BC。EV 的保存条件如温度、环境 pH 和保存时间会影响 EV 的数量、质量和摄取，EV-BC 作为保存 EV 的最外层高度脆弱，-70°C 以下保存有助于保存 EV-BC 和 EV 的特性。
4. EV 生物分子冠（BC）的功能
EV-BC 在 EV 的生物学和治疗特性中起关键作用，可增加 EV 的信号传递能力，引起 EV 受体细胞更多功能变化，在免疫系统、自噬等过程中发挥作用，影响 EV 的移动性、结合 / 内化，改善血管生成、再生和免疫调节等。EV-BC 影响 EV 的摄取，包括调理素化和去调理素化、EV 聚集、靶向摄取等方面，还对癌细胞行为、药物释放有影响，且 EV-BC 的变化可作为疾病诊断的生物标志物。
5. 治疗应用中 EV 生物分子冠（EV-BC）的工程潜力
EVs 作为药物工具面临产量和质量等挑战，EV 工程包括 EV-BC 工程可克服这些挑战。EV-BC 可通过添加、去除和替换分子成分进行修饰和定制，工程策略分为生物、化学和物理策略。生物策略包括 EV 生产前的细胞来源选择、培养方法、细胞 priming、基因和代谢工程，以及 EV 生产后的酶关联 / 解离、四跨膜蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白操纵、抗体和肽处理、核酸关联 / 解离等。化学策略包括点击化学、巯基 - 马来酰亚胺交联、EV 涂层等。物理策略利用磁场、激光照射、超声照射等物理因素实现 EVs 的靶向递送和药物控制释放。
6. EV 治疗应用中与生物分子冠（BC）相关的关键点
EV-BC 的软层具有动态性，在形成过程中及分泌后会发生变化，EV 给药时需考虑其形成的动态持续时间直至达到稳定状态。EV 的给药途径和递送方法会影响 BC 组成和治疗效果，需根据疾病选择最佳途径，同时要考虑个体遗传变异等因素，关注工程化 EVs 的免疫原性和生物相容性。使用水凝胶或支架递送 EVs 可克服 EV 清除和药物持续释放等挑战，但 EV 在不同凝胶和构建物中的进入是否影响 BC 功能及治疗特性需进一步研究。
7. 结论和未来展望
EV 工程在克服定制和靶向递送挑战方面有效，关注 EV-BC 的形成、变化和工程潜力对获得最佳效果至关重要。EV-BC 在 EV 功能中起重要作用，其工程可通过多种方法在 EV 生产前后进行。未来有望出现新的 EV-BC 工程方法，多功能工程可能是这些方法的 culmination，同时需利用人工智能分析复杂数据集。目前对 EV-BC 及其工程的理解仍处于早期阶段，诸多问题有待进一步研究。
