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为解决视网膜及视神经退行性病变中鞘磷脂（SM）影响机制研究的方法局限，研究人员利用增强型绿色荧光非毒性截短型溶神经素（EGFP-NT-Lys）结合无透化免疫组化法，发现 SM 在小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）和内皮细胞（RECs）质膜积累，该技术为相关研究提供新工具。
在生命科学领域，视网膜退行性病变和视神经病变一直是困扰研究者的难题。鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）作为细胞膜的主要成分，其在这些病变中的作用备受关注。然而，传统研究方法存在局限性，难以准确观察和分析 SM 在完整视网膜细胞中的分布及变化，导致人们对 SM 在退行性病变中的影响机制了解不足。为了突破这一瓶颈，深入探究 SM 在视网膜生理和病理过程中的角色，来自奥克兰大学（Oakland University）的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《Experimental Eye Research》上，为该领域的研究提供了新的思路和方法。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用增强型绿色荧光非毒性截短型溶神经素（Enhanced Green Fluorescent Protein-Non-Toxic Truncated Lysenin, EGFP-NT-Lys），结合无透化免疫组化法（permeabilization-free immunohistochemistry），该方法能够在保持细胞膜完整性的前提下对 SM 进行标记和观察；通过脂质斑点印迹分析（lipid dot blot assays）来确定 EGFP-NT-Lys 对 SM 及其种类的敏感性和选择性；还运用了竞争实验和 EGFP 共聚焦图像分析等技术，对 SM 的标记情况进行验证和分析。实验样本来自完整的小鼠视网膜。
结果
- 质粒验证与蛋白表达优化：通过限制性酶切验证了 EGFP-NT-Lys 质粒的身份，DNA 片段大小与预期一致。通过测量荧光强度，对细菌表达方案进行优化，以确保获得大量有功能的 EGFP-NT-Lys。
- EGFP-NT-Lys 的选择性与结合特性：脂质斑点印迹分析表明，EGFP-NT-Lys 对 SM 具有高度选择性，且优先结合长链 SM。用分解酶鞘磷脂酶（sphingomyelinase）处理可改变 EGFP-NT-Lys 对 SM 的标记，竞争实验和 EGFP 共聚焦图像分析进一步证实了 EGFP-NT-Lys 与 SM 的结合。
- SM 在视网膜中的分布：对小鼠视网膜铺片进行免疫荧光共聚焦图像分析，结合 RGC 和 REC 标记物及 EGFP-NT-Lys 标记，发现 SM 大量积累在视网膜血管内及 RGC 周围。
结论与讨论
本研究首次利用 EGFP-NT-Lys 结合无透化免疫组化法，在完整视网膜的特定细胞类型中实现了与质膜相关的 SM 的可视化。研究结果表明，该技术可用于检测和定量完整视网膜中特定细胞的质膜 SM，为研究视网膜退行性病变和视神经病变对特定视网膜细胞类型中 SM 积累的影响提供了新方法。由于 SM 在尼曼 - 皮克病、帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的病理生理学中具有重要作用，该技术有望为这些疾病的研究提供新的视角和工具，推动相关领域对 SM 作用机制的深入理解，为疾病的诊断和治疗提供潜在的靶点和思路。
