灵芝抗氧化肽的机器学习筛选与作用机制：虚拟预测、实验验证及分子动力学解析

本研究针对天然抗氧化肽筛选效率低、机制不明确等问题，通过整合机器学习结构特征分析与Keap1结合亲和力预测，从灵芝蛋白中鉴定出AIGQEFK等3种新型抗氧化肽，实验证实其自由基清除能力及Keap1-β55-66结合位点破坏机制，为功能性食品开发提供创新策略。

　　

在慢性疾病高发的当代社会，氧化应激作为多种疾病的共同病理基础备受关注。传统合成抗氧化剂因安全性争议（如Tang等指出的潜在健康风险）促使科研界转向天然来源抗氧化剂开发。其中，药用真菌灵芝（Ganoderma lucidum）虽以多糖和三萜类研究为主，但其肽类组分——这个"被忽视的宝藏"（Balkrishna等用语）的抗氧化潜力长期未被充分挖掘。更关键的是，现有预测模型多局限于肽段理化性质（如QSAR模型），忽视其与氧化应激核心调控蛋白Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）的相互作用机制，导致预测结果与生物活性脱节。

针对这些瓶颈，中国国家自然科学基金资助的研究团队在《Food Bioscience》发表突破性成果。他们创新性地将机器学习虚拟筛选与分子动力学模拟相结合，从4936个灵芝蛋白酶解肽段中锁定AIGQEFK、AFMFPER和AAWEFWNK三个候选肽。实验显示这些肽不仅能高效清除ABTS^+·（AAWEFWNK达76.33%）和DPPH自由基，更通过特异性结合Keap1的G₅₅-S₆₆β-折叠区域，破坏其与转录因子Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）的结合能力，从而激活内源性抗氧化通路。

关键技术包括：（1）基于NCBI灵芝蛋白数据库的虚拟酶解与机器学习筛选；（2）DPPH/ABTS自由基清除实验验证；（3）分子动力学模拟分析Keap1-肽复合物稳定性；（4）圆二色谱检测β-折叠构象变化。所有数据已公开于Zenodo（记录号15227543）。

【虚拟筛选】
通过模拟胰蛋白酶水解NCBI灵芝蛋白库获得4936个3-8肽段，经三重算法预测筛选出抗氧化评分最高的三个肽段，其中AAWEFWNK被预测具有最强自由基中和能力。

【实验验证】
HPLC证实候选肽存在于实际酶解产物中。自由基清除实验显示AAWEFWNK对ABTS^+·清除率显著优于同类（76.33% vs 46.33% DPPH清除率的AIGQEFK），且均呈现剂量依赖性。

【机制解析】
200ns分子动力学模拟揭示：三个肽通过氢键网络稳定结合Keap1的Kelch结构域，特别是AIGQEFK诱导G₅₅-S₆₆区域β-折叠解旋达42%，直接干扰Keap1-Nrf2蛋白互作界面。

这项研究的意义在于：首次建立"结构特征-Keap1亲和力"双维度筛选模型，突破传统QSAR局限；发现灵芝肽通过变构调节Keap1激活Nrf2通路的新机制；为开发基于食用真菌的抗氧化功能食品提供理论依据。研究团队特别声明使用ChatGPT仅用于语言优化，所有结论均经严格实验验证。这种"AI辅助发现+实验验证"的研究范式，为天然产物活性成分开发树立了新标杆。