32×32点阵高速共聚焦荧光寿命成像技术实现活细胞动态分子互作实时监测

为解决活细胞FLIM成像速度慢、光毒性高的问题，Morgan Richards团队开发了32×32点阵复用共聚焦系统，通过优化光路设计和扫描同步性，将FLIM-FRET成像速率提升至4 Hz（960×960像素）。该系统在10μM Coumarin6检测限下仍保持99%视场，成功应用于HEK293T细胞FRET动态监测，为药物筛选和细胞信号通路研究提供新工具。

　　

在生命科学领域，实时观测活细胞内分子互作动态犹如用高速摄像机捕捉蜂鸟振翅——传统技术往往力不从心。荧光寿命成像显微镜（FLIM）虽能通过荧光分子“寿命指纹”精准反映蛋白互作（如FRET现象），但现有共聚焦系统受限于单点扫描模式，成像速度仅约0.1帧/秒，难以捕捉亚秒级生物事件。更棘手的是，长时间激光照射引发的光毒性和光漂白效应，让活细胞实验常陷于“观测即破坏”的困境。

加拿大麦克马斯特大学等机构的研究团队另辟蹊径，将微透镜阵列（MLA）与创新性窗扫描技术结合，打造出32×32点阵并行扫描的共聚焦FLIM系统。这项发表于《Discover Imaging》的研究，通过重构光路（采用300μm间距MLA和25μm针孔阵列）、优化窗扫描器连续扫描算法（消除双向扫描伪影），并利用时间门控SPAD阵列探测器实现三时间窗快速寿命计算（RLD算法），最终在保持<0.5μW/焦点超低功耗下，将960×960像素FLIM成像速率提升至4 Hz——比前代技术快12倍。该系统成功捕捉到HEK293T细胞中mCerulean3-Venus FRET构建体（寿命2.3±0.3 ns）的动态变化，为药物靶点验证和细胞信号通路研究开辟了新维度。

关键技术方法包括：1）32×32微透镜阵列生成1024个并行激发点；2）300μm间距针孔阵列实现共聚焦滤波；3）双窗扫描器连续扫描（最高速度4.1 fps）；4）三时间门（3 ns宽度）SPAD阵列采集；5）快速寿命判定（RLD）算法实时处理。实验样本涵盖Convallaia rhizome双染切片、Coumarin6/Fluorescein稀释系列（10 nM-10μM）及转染mCerulean3/Venus的HEK293T细胞。

【结果解析】
光学系统设计：
通过图1所示简化光路，团队用多模光纤匀化激光（440 nm/50 MHz），经MLA分束后通过定制针孔阵列（25μm/300μm）实现共聚焦。关键突破在于窗扫描器的折射扫描方式避免了传统振镜的像场畸变，使1024个焦点能同步位移。

扫描同步性优化：
图2揭示窗扫描器在250μs像素驻留时间下可实现0.28s/帧（3.7 Hz）。图3展示通过40μs步进校准（-2~2 ms范围）消除双向扫描错位，使Convallaia样本（图5）的2.4/2.9 ns双峰寿命分布清晰呈现。

时间门校准：
图4显示三时间门（3 ns宽度+2 ns间隔）与Coumarin6衰减曲线（1μM）的卷积结果，确定门1-2间隔2.6 ns为最优参数。RLD算法在25光子阈值下（图6a），对10μM Coumarin6（2.5±0.2 ns）和Fluorescein（4.1±0.7 ns）的测量误差<5%。

活细胞FRET验证：
图8-9证实系统可区分mCerulean3单转染（3.8±0.3 ns）与mCerulean3-Venus FRET构建体（2.3±0.3 ns）。250μs驻留时寿命分布展宽（±0.3 ns vs 1000μs时的±0.2 ns）揭示高速成像的精度-速度权衡。

【结论与展望】
这项研究将多焦点共聚焦FLIM技术推入视频级时代，其4 Hz/百万像素的成像能力首次实现对活细胞FRET动力学的持续监测。通过MLA-针孔阵列的“光路复用”设计，系统在保持共聚焦分辨率的同时，将光子通量提升1024倍，使超低功率（0.15μW/焦点）成像成为可能。未来若结合共振扫描（潜在提升至数十Hz）和多指数衰减分析算法，有望进一步解密神经突触传递、心肌细胞电耦合等毫秒级生物过程。该技术已通过McFocal Bioimaging公司走向商业化，为精准医疗和药物开发提供全新观测窗口。