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为解决培养阴性微生物角膜炎的诊断难题，研究人员对 8 例角膜刮片 KOH+CFW（氢氧化钾 + 荧光白）示酵母样结构但培养阴性的感染性角膜炎患者，采用 PCR 及 DNA 测序，发现 7 例为白念珠菌、1 例为马特酵母，强调此类结构需警惕真菌病原，具诊断提示意义。
真菌性角膜炎是一类严重威胁视力的感染性眼病，其病原体诊断依赖微生物检测技术。传统的角膜刮片显微镜检查和培养方法虽为一线手段，但常面临挑战：部分真菌在显微镜下呈现非典型形态，与其他微生物（如微孢子虫）难以鉴别，且培养阴性结果可能掩盖真实感染，导致漏诊或延误治疗。尤其在免疫功能异常或复杂眼表环境中，酵母样真菌如念珠菌的感染表现更为隐匿，其临床特征与细菌性角膜炎相似，易造成误诊，进而影响抗真菌治疗的及时启动。因此，如何精准识别这类非典型病原体，成为眼科微生物诊断领域的关键问题。
为解决上述困境，印度布巴内斯瓦尔的 L V Prasad 眼科学研究所（国内研究机构）的研究团队开展了一项回顾性病例系列研究。该研究聚焦于 8 例临床疑似微生物角膜炎患者，其角膜刮片在 KOH+CFW（氢氧化钾 + 荧光白）染色下呈现圆形至椭圆形的非典型酵母样结构，但常规培养均无真菌生长。通过分子生物学技术深入分析，研究揭示了这些结构的真实身份，并探讨了其临床意义。相关成果发表在《Journal of Ophthalmic Inflammation and Infection》，为真菌性角膜炎的诊断提供了新视角。
研究采用的关键技术方法包括：
- 角膜刮片显微镜检查：在局部麻醉下采集角膜标本，进行 KOH+CFW 染色和革兰染色，观察微生物形态。
- 病原培养：将标本接种于多种培养基（如血琼脂、沙氏葡萄糖琼脂等），分别在 25℃和 37℃培养以检测真菌和细菌生长。
- PCR 及 DNA 测序：提取角膜刮片 DNA，利用泛真菌引物（ITS 基因）进行 PCR 扩增，通过 Sanger 测序和 NCBI-BLAST 分析鉴定病原体。
研究结果
1. 患者临床特征与微生物形态观察
- 人口学与病史：8 例患者中 5 男 3 女，年龄 8-81 岁，63% 有眼外伤史（如石块、植物碎屑伤），13% 有白内障手术史，2 例曾使用糖皮质激素。溃疡多为深基质浸润，4 例视力低于 20/200。
- 显微镜下表现：KOH+CFW 染色显示圆形至椭圆形荧光结构，部分具高亮极点球状结构，但无典型酵母出芽或假菌丝形态，革兰染色仅部分病例可见非特异性结构。培养均未检出真菌，4 例有细菌污染生长。
2. 分子生物学鉴定结果
- PCR 检测：所有样本均扩增出真菌 DNA（约 259 bp），而 12 例培养阴性对照样本无扩增，证实检测特异性。
- 测序分析：7 例鉴定为白念珠菌（Candida albicans），1 例为马特酵母（Citeromyces matritensis），与 GenBank 序列同源性 > 99%，覆盖度 > 95%。
3. 治疗与预后
- 药物治疗：主要使用 0.15% 两性霉素 B 或 5% 那他霉素滴眼液，5 例溃疡瘢痕愈合，1 例因治疗无效行穿透性角膜移植（TPK）后植片感染，1 例眼球萎缩，1 例失访。
- 视力转归：4 例末次随访视力优于 20/200，3 例视力差，提示早期分子诊断对改善预后至关重要。
研究结论与讨论
本研究表明，角膜刮片 KOH+CFW 染色中出现的非典型酵母样结构（无出芽、具高亮极点球状结构），即使在培养阴性时，也应高度怀疑真菌感染。分子生物学技术（PCR 联合测序）可突破传统培养限制，精准鉴定病原体，尤其适用于疑难病例。研究首次在角膜感染中检测到马特酵母，拓宽了真菌性角膜炎的病原谱。
讨论指出，此类非典型形态可能与真菌在宿主环境中的形态转换（如酵母 - 菌丝相转换）有关，其极点球状结构可能与高尔基体定位相关。KOH+CFW 染色的高灵敏度优于革兰染色，但需结合高倍镜（100× 物镜）观察以避免漏诊。此外，培养阴性可能源于病原体活性低或样本量少，凸显分子诊断在培养阴性病例中的不可替代性。
该研究的临床意义在于：① 提示眼科医生及微生物学家重视 KOH+CFW 染色中的非典型结构，避免误诊为细菌或微孢子虫感染；② 强调分子生物学技术在真菌性角膜炎诊断中的关键作用，尤其是培养阴性或重症病例；③ 为临床早期启动抗真菌治疗提供依据，降低角膜移植率和视力丧失风险。尽管研究样本量较小，但其发现为真菌性角膜炎的诊断流程优化提供了重要参考，推动分子诊断技术在感染性眼病中的普及应用。
