基于CRISPR/Cas9技术构建携带PAH深部内含子变异c.1199+502A>T的人类化小鼠模型及其表型研究

推荐 为解决现有PKU（苯丙酮尿症）小鼠模型无法模拟人类PAH基因深部内含子变异c.1199+502A>T的致病性问题，甘肃省妇幼保健院等机构研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了首个人类化Pah c.1199+502A>T纯合突变小鼠模型。结果显示，该模型呈现典型PKU表型，包括高血清苯丙氨酸浓度、认知障碍等，为研究深部内含子变异的致病机制及治疗策略提供了新工具。

　　

论文解读
苯丙酮尿症（PKU）是一种常见的氨基酸代谢遗传病，由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变引起。全球发病率约为万分之一，但不同地区差异显著，中国平均发病率为1/15,924，甘肃高达1/3,420。PKU患者若未及时治疗，会出现智力障碍、发育迟缓等症状，严重影响生活质量。目前，针对PKU的治疗手段包括低苯丙氨酸饮食和新型药物，但这些方法对携带深部内含子变异的患者效果有限。深部内含子变异（位于外显子-内含子边界100 bp以外）近年来被发现与PKU密切相关，其中c.1199+502A>T是最常见的变异之一，主要出现在经典型或轻型PKU患者中。然而，由于缺乏合适的动物模型，其致病机制研究受限。

为此，甘肃省妇幼保健院、国家卫生健康委科学技术研究所等机构的研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了携带人类PAH基因外显子11-12区域c.1199+502A>T变异的人类化小鼠模型。通过将人类PAH基因的特定片段敲入C57BL/6J小鼠的Pah基因座，研究人员成功获得了纯合突变（HO）和野生型（WT）小鼠，并对其表型进行了系统分析。

研究结果表明，纯合突变小鼠表现出典型的PKU表型，包括血清苯丙氨酸浓度显著升高、毛发变黄、体重增长缓慢等。此外，突变小鼠在Morris水迷宫实验中表现出空间学习和记忆能力下降，提示认知功能受损。研究还发现，突变小鼠的代谢参数异常，如氧气消耗和二氧化碳产生量增加，但垂直运动能力下降。

这项研究首次构建了携带PAH深部内含子变异c.1199+502A>T的人类化小鼠模型，为深入研究该变异的致病机制提供了重要工具。研究结果支持该变异与经典型PKU的关联，并为开发针对深部内含子变异的治疗策略奠定了基础。

主要技术方法
研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术，将人类PAH基因外显子11-12区域（含c.1199+502A>T或野生型序列）敲入C57BL/6J小鼠的Pah基因座。通过PCR扩增和测序验证阳性小鼠，并进行代谢参数分析和Morris水迷宫实验评估认知功能。

研究结果
PKU表型在人类化Pah c.1199+502A>T模型小鼠中的表现
纯合突变小鼠表现出反应迟钝、毛发变黄等典型PKU症状，体重显著低于杂合子和野生型小鼠。血清苯丙氨酸浓度检测显示，纯合突变小鼠的苯丙氨酸水平显著升高，符合经典型PKU特征。

代谢参数分析
纯合突变小鼠的氧气消耗和二氧化碳产生量显著高于野生型和杂合子小鼠，表明其代谢活性增强。然而，垂直运动能力显著下降，可能与能量代谢异常有关。

空间学习和记忆能力评估
Morris水迷宫实验结果显示，纯合突变小鼠的逃避潜伏期延长，目标象限停留时间和平台穿越次数减少，表明其空间学习和记忆能力受损。

研究结论与讨论
本研究成功构建了首个人类化Pah c.1199+502A>T小鼠模型，证实该变异可导致经典型PKU表型，包括高苯丙氨酸血症、认知障碍等。研究结果为深部内含子变异的致病机制研究提供了新工具，并为开发针对性治疗策略提供了参考。未来研究可进一步探索该模型的药理学反应，以验证新型治疗手段的有效性。

值得注意的是，尽管小鼠和人类的代谢途径存在差异，但本研究结果表明，人类化小鼠模型在模拟PKU病理特征方面具有较高准确性。这一发现强调了人类化动物模型在罕见病研究中的重要性，并为其他深部内含子变异相关疾病的研究提供了借鉴。

总之，本研究通过基因编辑技术成功模拟了PKU的致病机制，为理解深部内含子变异的影响及开发新型治疗策略奠定了基础。研究结果不仅推动了PKU领域的科学发展，也为其他遗传性代谢病的研究提供了重要参考。