基于牛津纳米孔技术的肉碱转运与循环障碍多基因诊断试剂盒的开发与临床验证

为解决肉碱转运与循环障碍（CCD）诊断中存在的表型重叠、分子诊断效率低等问题，研究人员开发了首个兼容牛津纳米孔技术（ONT）的多基因诊断试剂盒，靶向CPT-1、CPT-2、SLC22A5和SLC25A20基因。通过20例患者队列验证，该试剂盒与二代测序结果100%一致，并利用生物信息学工具解析了未知意义变异（VUS）的致病性。该研究为CCD的新生儿筛查和精准诊断提供了高效、经济的解决方案。

　　

肉碱是人体能量代谢的关键分子，负责将长链脂肪酸转运至线粒体进行β-氧化。当肉碱转运或代谢通路中的关键基因如CPT-1、CPT-2、SLC22A5（OCTN2）或SLC25A20（CACT）发生突变时，会导致肉碱转运与循环障碍（CCD），表现为低酮性低血糖、心肌病甚至猝死。尽管串联质谱（MS/MS）可用于新生儿筛查，但传统方法存在假阳性高、无法区分CCD亚型等问题。分子诊断虽能弥补这一缺陷，但二代测序（NGS）成本高、周期长，且短读长难以覆盖复杂变异。

为突破这些限制，来自土耳其伊斯坦布尔大学的研究团队开发了一种基于牛津纳米孔技术（ONT）的CCD多基因诊断试剂盒。该研究通过优化21对长片段PCR引物，实现了CPT-1、CPT-2、SLC22A5和SLC25A20基因的全覆盖扩增（4-7 kb），并利用ONT平台完成测序。研究纳入20例经Illumina平台确诊的CCD患者（包括CPT-1缺乏症5例、CPT-2缺乏症8例和原发性肉碱缺乏症7例），结果显示两种技术检测致病性变异的一致性达100%。此外，通过MutPred2和Missense3D等工具对未知意义变异（VUS）进行功能预测，发现CPT-1 p.Pro247Leu等新发变异可能通过破坏酶活性位点导致疾病。

关键方法

1. 样本队列：20例CCD患者（3例新生儿、12例儿童、5例成人）来自伊斯坦布尔大学儿科代谢门诊，均经MS/MS和Illumina临床外显子测序确诊。
2. ONT试剂盒设计：采用双管多重长片段PCR策略，覆盖基因编码区、UTR及已知致病性内含子区域。
3. 生物信息学分析：结合Clair3-Trio变异检测、ACMG分类标准及SWISS-MODEL结构模拟，解析VUS的致病机制。

研究结果

1. Panel优化：引物池扩增效率验证显示平均读长>4 kb，质量分数Q30，目标区域覆盖度完整。
2. 变异检测：检出CPT-2 p.Ser113Leu（62.5%土耳其患者高频突变）和SLC22A5 p.Gly152Arg（28.6%）等已知致病位点，与Illumina结果完全一致。
3. 新变异解析：CPT-1 p.His473Tyr（位于催化结构域）经MutPred2预测为可能致病（评分0.72），但Missense3D显示其结构影响较小，凸显多工具联合分析的必要性。
4. 成本效益：96样本批量处理时人均成本约35美元，耗时6小时，较NGS降低80%以上。

结论与意义
该研究首次证实ONT平台在CCD分子诊断中的可靠性，其长读长优势可有效捕获复杂变异。试剂盒的高性价比特别适合资源有限地区的新生儿筛查，并为其他单基因病诊断提供了技术范式。未来需扩大队列验证SLC25A20基因的检测效能，并通过功能实验明确VUS的临床意义。论文发表于《Orphanet Journal of Rare Diseases》，为罕见病精准诊疗树立了新标杆。