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该综述聚焦酶法回收 PET 塑料的关键挑战，通过合理设计结合高通量筛选平台对 PHL7 酶进行定向进化，获得四个活性与表达量提升的变体（如 PHL7-Jemez）。其在生物反应器中降解效率显著优于野生型及基准酶，为提升酶法 PET 回收的工业竞争力提供新策略。
研究背景与目标
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）作为全球产量最大的塑料之一，其废弃物积累带来严峻环境挑战。酶法回收 PET 因可持续性成为研究热点，但天然酶效率不足限制工业应用。本研究通过合理设计与定向进化结合高通量筛选平台，优化 PHL7 酶（Polyester Hydrolase Leipzig #7）性能，旨在提升其催化活性、热稳定性及表达量，推动酶法 PET 回收的经济性与实用性。
研究方法与过程
合理设计与定点突变
针对 PHL7 酶的活性位点及结构稳定性，引入盐桥（如 Q175E/R205K）和二硫键突变，通过分裂绿色荧光蛋白（GFP）互补筛选及 BHET 水解活性验证，筛选出 thermostability 提升的变体。同时，对活性位点（F63、L93、Q95 等）进行饱和突变，结合 PET 模型底物对接分析，确定关键功能位点。
定向进化与高通量筛选
利用基于 GFP11 标签的高通量筛选平台，对 PHL7 进行多轮定向进化。通过逐步增加筛选压力（如提高 BHET 浓度、延长热处理时间、提升 PET 底物负载量），筛选出催化效率显著提升的变体。第四轮进化后获得四个高性能变体：PHL7-Jemez、PHL7-Santa Fe、PHL7-Taos 和 PHL7-Tusas。
性能表征与对比
在不同条件（pH 6-9、温度 65-72°C、PET 结晶度 9.4%-41.8%）下评估变体性能。结果显示，PHL7-Jemez 在 2.9%（w/v）无定形 PET 薄膜中，48 小时水解率较野生型（PHL7-WT）提升 37%；在 20% 高负载下，水解率提升 270%。与基准酶 LCC-ICCG 相比，PHL7 变体在高缓冲浓度（1 M 磷酸盐）下表现更优，但低温及高结晶度底物中 LCC-ICCG 更具优势。
结构与动力学分析
利用 AlphaFold2 建模及 ROSETTA 分析，发现突变 Q95Y 通过 π- 堆积作用优化底物结合模式，盐桥突变 Q175E/R205K 增强结构稳定性。差示扫描量热法（DSC）显示，变体虽在低缓冲浓度下热稳定性略降，但高缓冲浓度可补偿稳定性损失，维持催化活性。
生物反应器应用验证
在生物反应器中，PHL7-Jemez 在 20% PET 负载下实现 70.5% 质量损失，显著高于野生型的 19.5%。尽管高负载下因离子强度问题导致水解率受限，但其初始速率及总转化率仍展现工业应用潜力。
结论与展望
本研究通过合理设计与定向进化结合高通量筛选，成功提升 PHL7 酶的 PET 解聚效率，为酶法回收提供新工具。未来需进一步优化酶在低缓冲浓度及高结晶度底物中的性能，结合反应器设计（如膜反应器）解决产物抑制与分离问题，推动可持续塑料回收技术发展。研究凸显定向进化平台在酶工程中的通用性，为其他工业酶优化提供借鉴。
