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为阐明 GH57 家族支链淀粉酶双催化活性机制，研究人员解析嗜热菌 AaApu 与含 α-1,4 和 α-1,6 糖苷键寡糖的共晶结构，发现 “Y” 型双结合口袋共享催化双元（Glu256 和 Asp352），为工业酶工程改造提供结构基础。
论文解读
研究背景与意义
淀粉水解是食品、医药和生物燃料等工业的核心环节，传统工艺需多步酶促反应，依赖耐高温酶与脱支酶协同作用。然而，现有脱支酶如支链淀粉酶虽能水解 α-1,4 和 α-1,6 糖苷键，但其催化机制和结构基础尚不明确，限制了工业应用中酶的优化改造。尤其是 GH57 家族支链淀粉酶作为嗜热酶，虽具备一步法淀粉糖化潜力，却因缺乏高分辨率结构信息，难以解析其双活性位点的协同机制。
中国科学院上海应用物理研究所、上海同步辐射光源等机构的研究团队，针对这一关键科学问题，开展了 GH57 家族支链淀粉酶的结构与功能研究。该研究成果发表于《Communications Biology》，通过解析嗜热菌 Aquifex aeolicus 来源的支链淀粉酶（AaApu）晶体结构，揭示了其独特的催化机制，为工业酶设计提供了重要理论依据。
关键技术方法
研究团队采用X 射线晶体衍射技术，解析了 AaApu 的空载结构及与阿卡波糖（acarbose）、麦芽五糖（G5）等寡糖的共晶结构，分辨率达 1.5-1.79 ?。通过定点突变（如 E256Q、E256L、D352N）结合薄层色谱（TLC）分析底物水解产物，验证催化位点功能。此外，利用分子动力学模拟（MD）预测支链寡糖与酶的结合模式，进一步确认双口袋机制的稳定性。
研究结果
1. 序列分析与酶活性表征
GH57 家族分为 7 个功能簇，AaApu 含 5 个保守区域（CSR），催化双元由 Glu256（亲核基团）和 Asp352（酸碱催化剂）组成。酶活实验表明，AaApu 在 pH 4.0-7.0、100-110℃保持 50% 以上活性，突变体（如 E256L、D352N）活性显著下降，证实催化位点的关键作用。TLC 显示其能水解支链淀粉、糖原等，兼具 α-1,4 和 α-1,6 糖苷键水解能力。
2. 晶体结构解析与活性中心特征
AaApu 结构为紧凑的（β/α）?桶状催化域，无额外结构域。与阿卡波糖共晶结构显示，寡糖结合于 - 4 至 - 1 亚位点，催化双元间距 6.9 ?，远超典型保留机制的 5 ?，暗示独特催化路径。当结合含 α-1,6 键的 G3G3’时，双糖占据 - 3 至 + 2 亚位点，α-1,6 键位于 - 1 与 + 1 亚位点之间，Glue256 与异头碳距离 3.3 ?，Asp352（突变体为 Asn352）与糖苷氧距离 3.4 ?，揭示双键水解的空间机制。
3. 双结合口袋模型
通过催化位点突变体共晶结构发现，AaApu 存在主结合口袋（深窄，容纳 - 5 至 - 1 亚位点）和次结合口袋（浅宽，容纳 + 1 至 + 2 亚位点）。主口袋优先结合线性链，次口袋结合支链链，二者共享催化双元，形成 “Y” 型结构。分子动力学模拟显示，支链寡糖结合时，柔性环（453-QGEEKAPFV-461）和门控残基 Phe409 通过构象调整稳定底物，验证了双口袋协同作用的合理性。
4. 底物结合与相互作用机制
芳香族残基（如 Trp449、Phe409）形成疏水平台，通过 π-π 堆叠和氢键稳定寡糖。α-1,4 键结合时，-1 与 + 1 亚位点寡糖发生弯折，降低水解能垒；α-1,6 键因柔性较高，无明显弯折。两种糖苷键的水解均依赖保守残基（如 Arg306、Lys308）与糖环的氢键网络，次口袋因结合力较弱，电子密度较低。
结论与讨论
本研究首次报道 GH57 家族支链淀粉酶的高分辨率晶体结构，揭示其通过双结合口袋共享催化双元的独特机制，解释了对 α-1,4 和 α-1,6 糖苷键的广谱水解能力。关键发现包括：①催化双元间距扩大（6.8-6.9 ?）可能是适应双糖苷键的结构基础；②“Y” 型口袋架构允许线性与支链淀粉的高效结合；③嗜热菌来源的酶结构特征（如 C 端螺旋束、疏水平台）赋予其热稳定性，契合工业高温需求。
该成果不仅填补了 GH57 家族支链淀粉酶结构研究的空白，更为工业酶改造提供了靶点。例如，通过优化柔性环或门控残基提升底物特异性，或通过调整催化位点间距增强热稳定性，有望开发出适用于一步法淀粉糖化的高效酶制剂，减少工业流程中的冷却步骤，提升生产效率并降低污染风险。此外，研究中提出的双口袋模型为其他脱支酶（如 GH13 家族）的结构 - 功能分析提供了参考，推动糖生物学与工业酶工程的交叉发展。
