优化微藻Chlamydomonas reinhardtii中ATP与多聚磷酸盐同步定量方法揭示其能量代谢调控新机制

本研究针对微生物能量代谢研究中ATP与多聚磷酸盐(polyP)同步定量难题，开发了基于中性酚-氯仿提取的直接采样优化方案。通过对比5种提取方法，证实该方案可精准测定生理状态下polyP/ATP比值(~70)，并成功应用于酵母、硅藻等微生物。该技术为探究polyP在能量缓冲与磷循环中的作用提供了关键工具，发表于《BMC Methods》。

　　

在生命起源与细胞能量调控研究中，多聚磷酸盐(polyP)作为古老的无机聚合物，从细菌到人类细胞中均扮演着磷酸盐储存、应激响应等多重角色。然而，其与能量货币ATP的动态关系始终是未解之谜。尤其在模式微藻Chlamydomonas reinhardtii中，前期研究发现缺失polyP合成酶VTC的突变体会积累过量ATP，暗示polyP可能通过"缓冲"ATP浓度参与能量稳态调控。但传统方法因ATP半衰期极短（秒级）、polyP提取效率低等问题，难以准确测定两者生理比值，严重阻碍相关机制研究。

针对这一技术瓶颈，来自中国科学院和索邦大学的研究团队在《BMC Methods》发表创新成果。他们开发了一种基于中性酚-氯仿的联合提取方案，通过直接采样避免离心应激，结合乙醇沉淀纯化步骤，首次实现了微生物生理状态下ATP与polyP的同步精准定量。研究证实，经典TCA法会完全丢失polyP，而优化方案提取效率比现有方法提升40%。更突破的是，该方法无需细胞数标准化即可计算polyP/ATP比值，为能量代谢研究提供了全新维度。

关键技术包括：(1) 中性酚-氯仿直接裂解培养液样本；(2) 双氯仿萃取去除酚残留；(3) ATP荧光素酶即时检测；(4) polyP乙醇沉淀富集与酶法链长分析；(5) 跨物种验证（酵母W303背景株、硅藻Thalassiosira pseudonana等）。所有实验均使用对数期细胞，通过叶绿素荧光(F_v/F_m)监测生理状态。

METHODOLOGY

研究系统比较了5种提取方案："Chida"法(ATP专用)、"Promega"TCA法、"Bru"与"Christ"polyP方案及优化方案。结果显示，优化方案ATP提取量与Promega法相当（1.0±0.08 mM），而polyP回收率比未沉淀的"Christ"法高13倍（20.4 vs 1.5 fmol/细胞）。离心处理会使ATP降低32%，证实直接采样对维持生理状态至关重要。

Open Access

通过向培养基添加ATP/polyP标准品，发现该方案对ATP回收率>100%（可能因细胞基质稳定作用），而对polyP的回收呈现链长依赖性：≥14个磷(P)单元时完全回收，但三磷酸(P₃)仅25%。这提示短链polyP可能被低估，但C. reinhardtii主要含长链polyP（平均200 P，最长数千P），故影响有限。

Results

电泳与酶法分析揭示，CC-4533菌株polyP呈广谱分布（1000-2000 P为主），远超商业标准P700（实际仅79 P）。跨物种测试显示，polyP浓度差异显著：蓝藻Gloeomargarita lithophora达519 mM，而硅藻T. pseudonana仅16 mM。值得注意的是，同步培养的硅藻Phaeodactylum tricornutum比异步培养多积累3.8倍polyP，暗示光周期调控作用。

Discussion

该研究建立的polyP/ATP比值测定体系，突破了传统方法因代谢物稳定性差异导致的系统误差。70:1的生理比值支持polyP作为"ATP缓冲池"的假说，为理解VTC酶在能量再分配中的作用提供量化依据。方案适用性广，从单细胞蓝藻（4 μm3）到大型真核藻类（300 μm3）均适用，特别适合低密度样本（如环境微生物）。未来可应用于缺磷应激、生物钟调控等研究，也为废水处理中聚磷菌监测提供了新工具。

这项技术的核心创新在于：首次实现无需标准化的生理比值测定，避免细胞计数误差；通过直接采样捕获毫秒级ATP动态；乙醇沉淀步骤兼顾polyP纯化与浓缩。作者特别指出，3 μm过滤可能导致polyP富集小细胞/碎片的丢失，建议后续开发单细胞分析方案。随着对polyP在神经退行性疾病、病原体耐药性等领域作用的深入，该方法将展现更广泛的应用前景。