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急性髓系白血病（AML）中非编码遗传变异（尤其顺式调控元件 CREs）作用机制不明。本研究利用单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）分析 10 例 AML 患者骨髓样本，开发 eMut 算法鉴定 2878 个潜在体细胞非编码突变，揭示其细胞类型特异性，为 AML 异质性研究提供新视角。
在生命科学和医学领域，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）一直是备受关注的恶性血液疾病。其诊断和分型高度依赖基因突变和基因重排等编码区变异的检测，像 DNMT3A、FLT3 等基因的突变已成为临床诊疗的重要依据。然而，大量研究表明，许多 AML 患者缺乏可检测的编码区突变，且同一分子亚型患者间临床表型差异显著，这暗示着非编码区变异，尤其是顺式调控元件（cis-regulatory elements，CREs）中的变异，可能在 AML 的发生发展和异质性形成中扮演着关键角色。CREs 如增强子等通过调控基因表达时空模式影响细胞命运，其突变可能破坏转录因子（transcription factor，TF）结合，导致基因表达失调。但由于技术限制，非编码突变的检测和功能解析一直是领域内的难题，亟需新的研究方法来揭示其在 AML 中的作用机制。
为填补这一研究空白，厦门大学、福建医科大学附属协和医院等机构的研究人员开展了相关研究。他们利用单细胞染色质可及性测序（single-cell chromatin accessibility sequencing，scATAC-seq）等多组学技术，对 10 例初诊 AML 患者的骨髓样本进行分析，旨在系统挖掘非编码区的功能性突变及其对 AML 细胞异质性的影响。该研究成果发表在《Communications Biology》上，为 AML 的精准诊疗提供了重要的理论依据。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先是 scATAC-seq 技术，结合 Paired-seq 方法改进，实现单细胞水平染色质开放区域的检测；其次开发了 eMut 整合计算流程，用于单细胞水平 CREs 中非编码突变的检测、插补和功能表征；同时结合 bulk ATAC-seq、RNA-seq 和 H3K27ac CUT&Tag 等多组学数据，对突变的功能进行验证和分析。样本来自福建医科大学附属协和医院等机构的 10 例 AML 患者，经伦理审批和患者知情同意后采集骨髓样本。
单细胞及批量多组学分析揭示 AML 骨髓细胞异质性
通过 scATAC-seq 对 10 例 AML 患者骨髓样本进行分析，获得 69,088 个高质量细胞，鉴定出 8 个不同细胞簇，包括造血干细胞样（HSC-like）、未成熟髓系祖细胞样（IMP-like）等主要恶性细胞类型。各肿瘤样本均呈现优势细胞簇，提示肿瘤细胞的克隆性扩增。标记基因的活性和表达分析显示，不同细胞簇中标记基因的启动子可及性存在差异，且富集 lineage-determining 转录因子，如 HSC-like 簇中的 RUNX1 和 TAL1，为后续非编码突变的细胞类型特异性分析奠定了基础。
eMut 算法检测单细胞非编码突变并解析其功能
当前利用单细胞 ATAC-seq 数据进行突变检测的流程主要分为识别单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异（CNV）以及适配单细胞数据分析的通用工具三类，但功能非编码突变的鉴定仍具挑战。为此，研究人员开发了 eMut 算法，该算法首先利用 Monopogen 或 GATK Mutect2 等工具在单细胞水平检测突变，考虑到 scATAC-seq 数据的稀疏性，通过网络传播对候选突变细胞进行插补。同时，eMut 包含四个功能解析模块，可识别细胞类型或谱系特异性突变、检测高突变 CREs、预测突变对转录因子基序的影响并将突变增强子与靶基因关联，以及比较突变型和野生型细胞的靶基因表达变化，实现了单细胞分辨率下非编码调控突变的检测、插补和功能表征。
AML 患者编码和非编码突变均呈现异质性
通过诊断基因检测分析 10 例 AML 患者已知的编码遗传变异，检测到 FLT3-ITD 重排以及 NPM1、DNMT3A 等 AML 相关基因的突变，且各患者突变组合模式独特。利用 eMut 分析非编码突变，共鉴定出 2878 个潜在体细胞非编码突变，多数为患者特异性，突显了 AML 非编码突变的异质性。这些突变主要集中在 5’侧翼区、内含子和基因间区，突变谱与公开 AML 数据集的全基因组测序结果高度一致，拟合 COSMIC 突变特征，提示非编码和编码突变虽具异质性，但共享潜在突变过程。
复发性非编码突变具有细胞类型特异性
研究鉴定出 52 个至少在 3 例患者中存在的复发性非编码突变，细胞类型富集分析表明这些突变具有细胞类型特异性。例如，位于 PER1 增强子的 chr17:8156823:C:A 突变在 6 例 AML 样本中富集于增殖细胞；位于 EIF4EBP1 启动子的 chr8:38030499:C:G 突变富集于 HSC-like 簇。通过对突变细胞进行插补，进一步验证了这些突变在特定细胞类型中的分布，提示复发性非编码突变可能在 AML 细胞命运决定中发挥作用。
含突变的顺式调控元件与白血病发生相关
将鉴定出的体细胞突变映射至可及 CREs，得到 2542 个突变 CREs，其关联的靶基因中 AML 相关基因和癌症驱动基因的富集程度显著高于无突变 CREs。功能富集分析显示，这些突变 CREs 与细胞凋亡、造血细胞命运决定等过程相关。分析 germline 突变并鉴定高突变 CREs，其靶基因同样富集 AML 相关基因和癌症驱动基因，且高突变 CREs 中与血液相关性状的 GWAS SNPs 和 cis-eQTL 富集。与 SComatic 等方法相比，eMut 在突变 CREs 中富集功能性 CREs 的能力更优，表明 eMut 检测到的 CREs 中的遗传变异可能在调控白血病相关基因和白血病发生中起关键作用。
候选功能性非编码突变影响转录调控
多数（83%）体细胞突变显著改变转录因子结合基序，导致如 EGR1 和 SPI1 等转录因子结合位点的丢失或获得。通过比较突变样本与野生型样本的靶基因表达，发现 334 个非编码突变影响下游靶基因，其中 208 个突变与上调表达相关，126 个与下调表达相关。例如，在 HSC-like 细胞中，RXRA 和 E2F2 基序的获得分别与 RUNX3 和 ESR1 表达增加相关；在单核细胞样细胞中，ZNF628 基序的破坏与 RUNX2 表达降低相关。这些结果表明，非编码突变可通过改变转录因子结合基序调节下游靶基因表达，提示其作为 AML 发病调控驱动因子的潜力。
研究结论与意义
本研究通过单细胞和批量多组学分析，系统揭示了 AML 中非编码突变的分布、异质性及细胞类型特异性，开发的 eMut 算法为非编码突变的功能解析提供了新工具。研究发现非编码突变通过影响 CREs 功能和转录因子结合，调控靶基因表达，参与 AML 的发生发展和细胞异质性形成。这些结果不仅拓展了对 AML 发病机制的认识，也为 AML 的诊断生物标志物开发和治疗靶点筛选提供了新方向，尤其是针对非编码区变异的精准治疗策略有望为 AML 患者带来新的希望。尽管研究存在缺乏配对正常单细胞数据等局限性，但仍为 AML 的研究提供了重要的资源和理论基础，推动领域向非编码区机制研究的深入发展。
