海洋紫色光合细菌Rhodovulum sulfidophilum在自养与异养条件下的固氮效率评估及其代谢调控机制

本研究针对紫色非硫光合细菌(PNSB)在可持续材料生产中的应用潜力，通过15N标记实验和乙炔还原法，首次定量比较了海洋PNSB模式菌株Rhodovulum sulfidophilum在自养(NaHCO3)与异养(苹果酸)条件下的固氮效率。发现异养条件下菌株生长速率提升2倍，氮酶活性增强6.9倍，氨基酸15N吸收效率提高2.1-2.6倍，揭示了碳代谢模式对固氮-碳固定协同调控的关键影响，为海洋微生物资源化利用提供理论依据。

　　

在海洋生态系统中，紫色非硫光合细菌(Purple Non-Sulfur Bacteria, PNSB)因其独特的混合营养能力而备受关注。这类微生物既能利用有机碳源进行异养生长，又能通过光合作用固定无机碳，更拥有将大气氮气(N₂)转化为生物可利用氮的固氮能力。然而，长期以来研究者们将目光聚焦于其固氮基因nifHDK的表达调控，却忽视了碳代谢模式对固氮效率的深远影响。这一认知空白严重制约了PNSB在可持续生物制造领域的应用——要知道，若能阐明碳氮代谢的协同规律，这些微生物或将成为生产氨基酸、类胡萝卜素和生物塑料的"绿色细胞工厂"。

更令人困扰的是，现有研究数据存在明显局限性。多数固氮活性检测依赖乙炔还原法(ARA)，但该方法无法反映真实氮同化通量；而关于海洋PNSB代表种Rhodovulum sulfidophilum的研究，仅报道了其在异养条件下的氮酶活性。这引发了一系列关键问题：当R. sulfidophilum处于自养状态时，其固氮能力是否会因ATP分配冲突而受限？不同碳源如何通过代谢网络调控氮流向氨基酸合成的效率？这些问题的解答，对开发基于海洋微生物的废水处理-资源回收一体化技术至关重要。

京都大学与日本理化学研究所可持续资源科学中心的研究团队在《Scientific Reports》发表的这项研究，首次采用¹⁵N₂示踪技术结合传统乙炔还原法，系统比较了R. sulfidophilum DSM1374在自养(20 mM NaHCO₃+8 mM Na₂S₂O₃)与异养(20 mM苹果酸)条件下的固氮动力学。实验在严格厌氧的M6矿物培养基中进行，通过730 nm远红光(20 W/m²)提供能量，采用GC-MS定量分析15种氨基酸的¹⁵N标记效率。

主要技术方法

研究采用¹⁵N₂气体标记结合气相色谱-质谱(GC-MS)分析技术，定量检测氨基酸中¹⁵N/¹⁴N比值；通过乙炔还原法测定氮酶活性；使用定制M6矿物培养基控制碳源类型；在24 mL玻璃瓶中建立严格厌氧培养系统；采用三级同位素校正算法处理质谱数据。菌株来源于ATCC35886/DSM1374标准菌库。

异养条件显著促进生长和氮酶活性

比较两种碳源下的生长曲线发现，72小时后异养组的菌体密度(OD₆₆₀)达到自养组的2倍。对应地，乙炔还原实验显示异养条件下氮酶活性持续高出80-86%，第三日差异达6.9倍(69±8 vs 10±1 nmol C₂H₂ h^-1OD₆₆₀^-1)。这表明苹果酸作为TCA循环直接底物，能提供更充足的ATP和还原力驱动固氮过程。

¹⁵N同化效率的碳源依赖性

GC-MS分析揭示出惊人的代谢差异：所有检测氨基酸的¹⁵N标记效率在异养条件下均显著提升，第三日差异幅度为2.1-2.6倍。特别值得注意的是，培养首日不同氨基酸间呈现梯度差异——Ser、Ala、Gly的标记效率差异最大(3.1-3.7倍)，而His、Asp、Glu仅差1.4-1.6倍。这种分化暗示苹果酸可能通过增加丙酮酸(PYR)合成，优先强化糖酵解支路氨基酸的生物合成。

代谢流重编程的深层机制

研究人员构建了碳氮代谢网络模型来解释上述现象：在异养条件下，苹果酸经苹果酸酶转化为PYR，不仅为TCA循环提供乙酰-CoA，还通过增加糖异生前体供应促进Ser/Gly/Ala合成。同位素数据还发现异亮氨酸(Ile)标记效率提升2.5倍，这与前人报道的PNSB通过还原性Ile合成维持氧化还原平衡的机制相符。相比之下，自养组因ATP大量消耗于卡尔文循环，导致谷氨酸(Glu)合成受限——而Glu恰是24种氨基酸的氨基主要供体，这最终造成全局性氮同化抑制。

结论与展望

该研究首次定量证实了R. sulfidophilum在自养和异养条件下的固氮能力差异，揭示出碳代谢模式通过能量分配和氧化还原平衡双重机制调控固氮效率的规律。特别重要的是，¹⁵N示踪技术显示实际氮同化效率差异(2.6倍)远小于氮酶活性差异(6.9倍)，说明传统乙炔还原法可能高估代谢差异。这些发现为优化海洋PNSB培养策略提供了关键参数：在废水处理等需快速积累生物量的场景，添加苹果酸等有机碳可显著提升效率；而在海洋寡营养环境，菌株则通过精细调控碳氮代谢比实现生存适应。

这项研究的深层意义在于，它建立了PNSB碳氮代谢偶联研究的标准化方法框架。未来通过整合组学技术和代谢工程手段，或可构建既能高效固氮又能适应不同碳源的工程菌株，真正实现"阳光驱动、废气为食"的可持续生物制造模式。正如作者强调的，在追求碳中和的今天，理解这些古老微生物的代谢智慧，或许能为人类打开一扇通向绿色生产的新大门。