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为解决现有结核疫苗保护效力不足问题，研究人员探究 TLR4 佐剂（MPL/DDA、GLA-SE）与 STING 激动剂 c-di-GMP（CDG）联合对结核亚单位疫苗的作用。发现 CDG 可增强 Th1 型免疫应答及肺组织驻留记忆 T 细胞，显著提升保护效果，为疫苗开发提供新策略。
结核病（Tuberculosis, TB）如同潜伏在人类社会的 “隐形杀手”，其病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）每年导致约 1000 万新增病例和 130 万人死亡。目前唯一获批的卡介苗（BCG）虽能有效预防儿童重症结核，却在预防成人最常见的肺结核方面效力参差不齐，且无法满足免疫缺陷人群的需求。开发更高效的结核疫苗成为全球公共卫生领域的迫切挑战。亚单位疫苗因兼具安全性和可量产性被寄予厚望，但其免疫原性较弱，亟需高效佐剂协同作用。在此背景下，韩国延世大学医学院等机构的研究人员开展了一项具有突破性的研究，相关成果发表在《Journal of Biomedical Science》，为结核疫苗的研发开辟了新思路。
研究人员聚焦于 Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4, TLR4）佐剂与刺激干扰素基因蛋白（Stimulator of interferon genes, STING）激动剂的协同作用，探究其对结核亚单位疫苗保护效力的提升机制。研究采用 C57BL/6 小鼠模型，通过肌肉注射方式进行三次免疫，间隔 3 周，末次免疫 4 周后以常规剂量或超低剂量 Mtb 气溶胶攻击，评估细菌负荷、肺部炎症及免疫细胞应答。
研究使用的关键技术方法包括：①流式细胞术（Flow Cytometry）：检测 CD4+T 细胞表面标志物（如 CD44、CD62L、KLRG1）及胞内细胞因子（IFN-γ、TNF、IL-2 等），分析免疫细胞表型和功能；②四聚体染色（Tetramer Staining）：利用 ESAT6-I-A (b) 和 Ag85B-I-A (b) 四聚体特异性识别抗原特异性 CD4+T 细胞；③组织病理学分析：通过 H&E 染色评估肺部炎症程度，计算炎症面积百分比；④菌落形成单位（CFU）计数：测定肺和脾脏中的细菌负荷，评估疫苗保护效力；⑤体内血管内标记：静脉注射荧光标记抗体（如 CD45.2、CD31）区分肺血管内和实质内的免疫细胞。
1. CDG 与 TLR4 佐剂联合增强抗原特异性 CD4+T 细胞应答
在 ESAT6 抗原与 MPL/DDA 佐剂组合中加入 CDG 后，小鼠血清中 ESAT6 特异性 IgG、IgG1 和 IgG2c 抗体滴度显著升高，且 Ag 特异性 CD4+CD44+T 细胞在肺和脾脏中的频率显著增加。多功能流式细胞术分析显示，CDG 组 CD4+T 细胞分泌 IFN-γ、TNF 和 IL-2 的能力显著增强，呈现 Th1 型免疫应答优势。此外，CDG 促进 ESAT6 特异性 CD4+T 细胞向肺实质和血管内募集，其中肺实质中的细胞表现出组织驻留记忆 T 细胞（Trm）样表型（CD69+CD62L-）。
2. CDG 提升疫苗对高毒力 Mtb 菌株的长期保护效力
在 Mtb HN878 菌株攻击实验中，ESAT6+MPL/CDG/DDA 免疫组在 4 周和 16 周时的肺脾细菌负荷均显著低于单纯 TLR4 佐剂组，且肺部炎症程度明显减轻。类似地，在 Mtb K 菌株攻击实验中，ESAT6+GLA-SE/CDG 组不仅细菌负荷低于 GLA-SE 单佐剂组，甚至优于 BCG 免疫组，显示出 CDG 对不同 TLR4 佐剂（MPL/DDA 和 GLA-SE）的普适性协同效应。
3. CDG 促进抗原特异性 T 细胞向肺组织募集并维持低分化状态
利用体内血管内标记技术，研究发现 CDG 显著增加 ESAT6 和 Ag85B 特异性 CD4+T 细胞在肺血管和实质中的分布，尤其是 ESAT6 特异性 Trm样细胞在肺实质中的比例显著上升。杀伤细胞凝集素样受体 G1（KLRG1）表达分析显示，CDG 组肺血管内 CD4+T 细胞的 KLRG1 水平显著降低，而肺实质中的细胞维持低分化状态，表现为功能性分化评分（FDS）降低，同时 Th17 型细胞因子 IL-17A 的表达增加，提示 CDG 通过调控 T 细胞分化和归巢增强保护效力。
4. CDG 在超低剂量 Mtb 攻击模型中凸显保护优势
在模拟自然感染的超低剂量 Mtb K 攻击实验中，BCG 免疫组未能显示保护作用，而 ESAT6/Ag85B+GLA-SE/CDG 组的肺细菌负荷显著低于单佐剂组和未免疫组。机制上，CDG 诱导的低分化 Th1 细胞和增强的 Th17 应答协同作用，可能是其在低抗原负荷下仍能有效控制感染的关键。
结论与意义
本研究首次系统揭示了 STING 激动剂 c-di-GMP（CDG）与 TLR4 佐剂联合使用可通过多重机制增强结核亚单位疫苗的保护效力：①协同激活先天免疫受体（TLR4 和 STING），促进 Th1 型和 Th17 型免疫应答；②诱导抗原特异性 CD4+T 细胞向肺组织募集并维持低分化、高功能状态；③提升组织驻留记忆 T 细胞的比例，实现对 Mtb 的长期免疫监视。这些发现不仅为结核疫苗的佐剂设计提供了 “TLR4+STING” 双通路激活的新策略，也为其他胞内病原体疫苗的研发提供了重要借鉴。未来，进一步优化 CDG 与不同抗原的组合及给药途径，有望加速高效结核亚单位疫苗的临床转化，为终结结核流行带来新希望。
