GMP标准化生产冷冻保存的CD34+祖细胞来源NK细胞产品及其在NOD/SCID/IL2Rγnull小鼠体内抗肿瘤功能研究

本研究针对自然杀伤（NK）细胞疗法临床应用中冷冻保存导致的细胞活性和功能损伤问题，开发了基于CD34+造血干祖细胞（HSPCs）的GMP标准化NK细胞（RNK001）生产工艺。通过优化冷冻方案和G-rex生物反应器扩增技术，获得高纯度CD56+CD3- NK细胞产品，冷冻后仍保持体内外抗肿瘤活性，为血液肿瘤和实体瘤提供"即用型"治疗选择。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞因其无需抗原预敏即可识别并杀伤肿瘤细胞的特性，成为极具潜力的异体治疗选择。然而现有NK细胞疗法面临两大技术瓶颈：一是传统外周血来源（PB-NK）存在供体间差异大、T细胞污染风险；二是冷冻保存会导致细胞活性和功能显著下降，迫使临床需进行耗时且昂贵的复苏后培养。这些限制严重阻碍了"即用型（off-the-shelf）"NK细胞产品的开发与应用。

针对这些关键问题，荷兰Radboud大学医学中心的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》发表了创新性解决方案。他们建立了从脐带血（UCB）CD34⁺造血干祖细胞（HSPCs）规模化生产冷冻保存NK细胞的全套技术体系。研究通过优化GMP生产流程，结合功能验证实验，证明该冷冻产品（RNK001）在解冻后仍保持优异的抗肿瘤活性，为临床提供标准化、可及性高的细胞治疗选择。

研究团队采用三大关键技术：1）使用G-rex生物反应器进行HSPCs扩增和NK细胞分化，显著减少人工操作步骤；2）建立优化的冷冻方案（CryoStor CS10培养基+程序降温）；3）建立包括3D肿瘤球模型、NOD/SCID/IL2Rγ^null（NSG）小鼠模型在内的多层次功能评价体系。所有实验均使用符合临床标准的脐带血来源细胞。

【GMP-compliant manufacturing】部分显示，采用G-rex生物反应器培养5周可实现平均767倍的扩增，获得1.4-2.4×10⁹个高纯度（94% CD56⁺CD3^-）NK细胞。相较于传统培养袋，新工艺将培养基添加次数从每2-3天一次优化为全程仅需6次，大幅降低污染风险。

【Cryopreservation protocol】部分证实，冷冻密度在10-100×10⁶细胞/mL范围内均能保持高回收率（75%）和活力（67%）。值得注意的是，存活细胞在IL-15刺激下表现出比新鲜细胞更强的增殖能力，提示冷冻可能选择性保留了高活性细胞亚群。

【Phenotype and function】数据显示，解冻后细胞维持成熟表型（NKG2D⁺、DNAM-1⁺、NKp46⁺），穿孔素（Perforin）表达与新鲜细胞相当。虽然在二维培养中杀伤效率暂时降低，但在更接近生理状态的3D胶原基质模型中，冷冻细胞对SKOV-3肿瘤球的溶解能力与新鲜细胞无差异。

【In vivo persistence】实验证明，无论是腹腔（i.p.）还是静脉（i.v.）注射，冷冻细胞在NSG小鼠体内的存续时间与新鲜细胞相当。特别值得注意的是，7天后从脾脏回收的冷冻NK细胞甚至表现出更强的脱颗粒（CD107a⁺）能力，而干扰素γ（IFNγ）产生水平保持稳定。

这项研究突破了NK细胞疗法产业化的关键技术瓶颈。通过GMP标准化生产体系，研究者成功将脐带血HSPCs分化为高纯度NK细胞产品，并证明其冷冻后仍保持体内外抗肿瘤功能。该技术已应用于复发急性髓系白血病（NCT04347616）和卵巢癌（NCT03539406）的临床试验，其创新性主要体现在三方面：1）工艺上采用封闭式生物反应器，实现规模化生产；2）冷冻方案确保产品"即用性"，免除复苏后培养环节；3）通过3D模型和NSG小鼠验证功能，为临床转化提供充分依据。这项研究为开发标准化、可及性高的异体NK细胞疗法奠定了重要基础，对推动肿瘤免疫治疗的产业化发展具有里程碑意义。