编辑推荐：
推荐
为解析共价药物与半胱氨酸的互作机制，研究人员利用 QTRP 技术对 70 种药物（含 58 种 FDA 批准药物）开展全蛋白质组半胱氨酸配体性分析，覆盖超 24,000 个半胱氨酸，鉴定 279 个潜在靶点，为共价药物开发提供关键资源。
论文解读
在药物研发领域，共价药物因其能与靶蛋白氨基酸形成共价键的独特作用方式，近年来备受关注。然而，这类药物常存在与多个蛋白结合的 “promiscuity（多效性）” 问题，且多数通过偶然发现而非定向设计获得，导致其与人体半胱氨酸组（cysteinome）的相互作用机制尚不明确。此外，早期共价药物因担忧脱靶效应和毒性而应用受限，尽管靶向共价抑制剂（TCIs）在癌症治疗中取得了如针对 EGFR、BTK 等靶点的成功，但如何系统性评估共价药物的全蛋白质组反应性和选择性，尤其是在单个位点分辨率水平，仍是亟待解决的关键科学问题。
为填补这一研究空白，北京蛋白质组研究中心、清华大学医学院等国内研究机构的研究人员开展了一项大规模化学蛋白质组学研究。该研究成果发表在《Nature Communications》上，通过构建涵盖 70 种具有半胱氨酸反应性化学型的药物库（包括 58 种 FDA 批准药物、2 种营养保健品和 2 种药用化妆品，简称 DPCCs），结合定量巯基反应谱（QTRP）技术，在体外和细胞内对超过 24,000 个人类半胱氨酸进行了系统性分析，旨在绘制全蛋白质组范围的半胱氨酸配体性图谱，揭示共价药物与半胱氨酸的相互作用规律，为共价药物的开发和应用提供全面的理论支持。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先是QTRP 技术，通过 HEK293T 细胞裂解液预处理药物，结合广谱半胱氨酸反应性探针 IPM 标记，经酶解、点击化学标记和富集后，利用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）进行定量分析；其次在细胞水平研究中，采用稳定同位素二甲基标记定量蛋白质组学技术，校正蛋白质丰度变化，筛选高置信度靶标；此外，还运用了免疫印迹、免疫沉淀、实时荧光定量 PCR、免疫荧光等分子生物学和细胞生物学技术，对关键靶点的相互作用和功能影响进行验证。
研究结果
药物半胱氨酸反应性筛选
在体外实验中，通过 QTRP 技术对 70 种 DPCCs 的半胱氨酸组反应性进行评估，发现 DPCCs 与 HEK293T 半胱氨酸组的平均反应性为 4.8%，16 种含丙烯酰胺的 TCIs 在相同浓度下表现出相当的反应性，但主成分分析（PCA）显示 TCIs 的靶点分布更具特异性。研究还鉴定出 207 个可被至少 10 种药物结合的 “混杂半胱氨酸”，这些位点可能代表随机标记事件，需在未来药物开发中避免。在激酶组分析中，DPCCs 可结合大量激酶，而 TCIs 仅靶向约 12 种激酶，表明 DPCCs 的靶点 promiscuity 更高。不同化学型药物的半胱氨酸反应性存在显著差异，其中含环氧（epoxide）弹头的药物反应性最强，含硝基（nitro）和丙烯醛（acrylic aldehyde）的药物反应性最弱，但 PCA 未显示明显的化学型特异性聚类，提示半胱氨酸结合能力受药物弹头固有反应性和非共价结合特性共同影响。
细胞内靶点分析
在细胞水平研究中，选择 4 种药物（依他尼酸、富马酸二甲酯、小白菊内酯、纳他霉素）进行高浓度（20 μM）处理，结合 QTRP 和定量蛋白质组学，鉴定出 279 个高置信度靶标半胱氨酸，涉及 1.6% 的总半胱氨酸和 3.8% 的蛋白质。其中，仅约 20% 的结合半胱氨酸曾被报道为基于片段的共价配体靶点，表明研究发现了大量新的配体可结合位点。功能注释显示，这些靶标蛋白包括传统小分子难以靶向的衔接 / 支架蛋白和转录因子等，且与癌症依赖图谱、癌症驱动因子和 ClinVar 错义变体等疾病相关注释高度关联，提示其潜在的治疗价值。
已知靶点的结合谱扩展
以 JAK1 激酶为例，研究发现其半胱氨酸 C988 可被纳他霉素特异性结合，该位点位于预测的变构口袋内，虽不影响 JAK1 的体外催化活性，但能在细胞内抑制 IL-4 和 IFNα 诱导的 JAK1-Stat6/Stat1 信号通路。突变实验证实，C988 位点的共价结合是纳他霉素发挥抑制作用的关键，表明该位点是 JAK1 的变构配体结合位点，为开发新型 JAK 抑制剂提供了新方向。
难成药蛋白的功能热点发现
核受体共激活因子 4（NCOA4）是一种传统认为 “不可成药” 的蛋白，其半胱氨酸 C244 可被三种 DPCCs（小白菊内酯、纳他霉素、依他尼酸）靶向结合。机制研究表明，药物结合 C244 可破坏 NCOA4 与铁蛋白重链 FTH1 的相互作用，抑制铁自噬（ferritinophagy）和游离铁释放，从而调控铁死亡（ferroptosis）过程。突变和敲低实验证实，C244 位点的共价修饰是药物发挥作用的关键，提示该位点可作为设计铁死亡抑制剂的潜在靶点。
共价药物作为 E3 连接酶招募剂的再利用
研究发现，依他尼酸可共价结合 E3 泛素连接酶 HECTD1 的半胱氨酸 C1368，通过与 BET 家族抑制剂（S）-JQ1 偶联，设计出 PROTAC 试剂 EtA-(S)-JQ1。该试剂可在细胞内有效降解内源性 BRD4 蛋白，其降解作用依赖于 HECTD1 的招募和蛋白酶体系统，且在相同条件下比非共价降解剂 MZ1 更有效。蛋白质组学分析显示，EtA-(S)-JQ1 具有较高的选择性，主要降解 BRD4 而不影响 BRD2/3，为 PROTACs 的开发提供了新策略。
研究结论与讨论
本研究通过大规模化学蛋白质组学分析，首次系统性绘制了 70 种临床共价药物的全蛋白质组半胱氨酸配体性图谱，鉴定出 279 个潜在靶标，其中包括已知靶点的新结合位点和传统难成药蛋白的配体可结合位点。研究不仅揭示了共价药物的 promiscuity 机制，还发现了变构位点、蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）界面等新型药物作用靶点，为共价药物的定向设计和老药新用提供了丰富资源。例如，JAK1 变构位点的发现为开发高选择性 JAK 抑制剂提供了新方向，NCOA4 靶点的验证为铁死亡调控药物开发奠定了基础，依他尼酸作为 E3 连接酶招募剂的应用拓展了 PROTACs 的设计思路。
此外，研究通过对比 TCIs 和 DPCCs 的靶点分布，证实了定向设计药物的高选择性优势，为评估新型 TCIs 的蛋白质组选择性提供了参考。同时，研究强调结合遗传和计算方法进一步解析新发现半胱氨酸的功能影响，以及在病理生理相关模型中验证药物 - 靶点相互作用的重要性，这将有助于加速共价药物的临床转化，为癌症、炎症性疾病等重大疾病的治疗带来新的希望。
该研究成果不仅是共价药物领域的重要突破，也为化学蛋白质组学在药物研发中的应用提供了经典范例，其建立的数据集和技术方法将持续推动精准药物开发和蛋白质组学研究的发展。
