基于SELEX技术的霍乱毒素B亚基高亲和力适配体开发及其检测应用研究

本研究针对霍乱早期诊断难题，通过不对称PCR优化和11轮SELEX筛选，成功获得特异性结合霍乱毒素B亚基(CtxB)的适配体，其检测限(LoD)达100±20 pg/ml，解离常数(KD)为320±60 pM。该研究为开发无需复杂设备的快速诊断试纸条(LFAs)提供了新型分子识别工具，具有重要临床应用价值。

　　

霍乱作为由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，每年在全球造成大量死亡病例。其致病核心霍乱毒素(Ctx)由A、B两个亚基组成，其中B亚基(CtxB)因表面暴露、高度保守的特性成为理想诊断靶点。然而当前金标准培养法耗时长达48小时，PCR技术虽灵敏却依赖专业设备，在资源匮乏地区难以推广。开发兼具高灵敏度、操作简便且成本低廉的检测方法成为防控霍乱传播的关键突破口。

伊朗伊斯兰阿扎德大学的研究团队在《Gene Reports》发表论文，创新性地采用系统进化配体指数富集(SELEX)技术筛选针对CtxB的特异性DNA适配体。这类单链核酸分子具有媲美抗体的结合特异性，且具备耐高温、可常温保存、成本低廉等独特优势，特别适合开发为无需冷链运输的快速诊断试纸条。

研究团队首先优化不对称PCR条件获得单链DNA文库，采用1:80引物比例、20个循环、57°C退火温度的最佳参数。经过11轮SELEX筛选和表面等离子共振(SPR)验证，最终获得对CtxB具有纳摩尔级亲和力的适配体AP16。该适配体与相似蛋白(StxB/LtB)的交叉反应性低于10倍，检测限达100±20 pg/ml，解离常数320±60 pM，性能指标满足现场检测需求。分子对接分析揭示了适配体与CtxB受体结合域的特异性相互作用机制。

材料与方法
研究使用含ctxB基因的pET28a质粒转化E. coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达后通过CNBr活化的Sepharose 4B纯化CtxB蛋白。SELEX筛选采用固定化靶标策略，结合不对称PCR扩增。亲和力评价采用酶联适配体吸附试验(ELASA)，结合SPR技术测定动力学参数。对照实验包括Shiga样毒素B亚基(StxB)和ETEC热不稳定肠毒素B亚基(LtB)的交叉反应测试。

表达与纯化CtxB
通过T7启动子诱导表达重组CtxB(rCtxB)，SDS-PAGE验证显示约11 kDa的目标条带，与理论分子量一致。Western blot进一步确认蛋白特异性，为后续筛选实验提供高纯度抗原。

讨论
相较于传统抗体，适配体AP16展现出显著优势：在室温下保持稳定超过1年，可通过简单变性-复性过程再生使用，且生产成本仅为抗体的1/10。研究首次证实针对CtxB五聚体结构的适配体可有效区分霍乱毒素与其他细菌肠毒素，为开发通用型霍乱诊断试纸条奠定基础。但需注意，当前适配体对部分流行株的检测灵敏度仍需优化。

结论
该研究成功建立基于SELEX的CtxB特异性适配体筛选平台，获得的AP16适配体具有良好诊断潜力。结合侧向层析技术，可进一步开发为适用于疫区的现场检测工具。未来工作应扩大临床样本验证，并探索适配体在毒素中和治疗中的应用价值。这项成果为应对霍乱等突发公共卫生事件提供了新的技术储备。