全基因组测序联合minigene解析揭示Bartter综合征1型SLC12A1基因新型深部内含子变异的分子机制

本研究针对一例临床疑似Bartter综合征1型（BS1）患者，通过全外显子测序（WES）和全基因组测序（WGS）鉴定出SLC12A1基因的新型深部内含子变异c.629-527 T > C，并通过minigene分析证实其导致异常剪接及提前终止密码子形成。该研究扩展了BS1的突变谱，凸显多组学整合在精准诊断中的价值。

　　

论文解读
Bartter综合征1型（BS1）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由SLC12A1基因突变引发，该基因编码的Na-K-2Cl共转运体NKCC2在肾小管髓袢升支粗段发挥关键作用¹。患者常表现为胎儿期羊水过多、早产及新生儿期呕吐、低钾血症等，若未及时诊治将导致生长发育迟缓及肾功能损害²。然而，约30%的BS1病例无法通过常规Sanger测序检出致病突变，提示需探索更深层次的基因变异机制。山东省潍坊市妇幼保健院的研究团队针对一例临床高度怀疑BS1的患儿，系统性整合全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）及minigene功能验证技术，成功鉴定出一种新型深部内含子变异并阐明其致病机理。

本研究采用WES初步筛选到杂合错义突变c.1391G > T（p.Gly464Val），但该变异不足以解释疾病表型。进一步通过WGS在全基因组范围内捕获到深度内含子区域变异c.629-527 T > C。为验证其功能，研究者构建含野生型及突变型SLC12A1基因片段的minigene载体转染HEK293细胞，发现突变型导致内含子4异常保留，产生移码突变p.Leu214IlefsTer31并引发提前终止密码子，而野生型则维持正常剪接模式。最终结合家系共分离分析，确认该复合杂合突变（c.1391G > T/c.629-527 T > C）为致病原因。

技术方法
本研究依托全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）及minigene功能验证体系开展。样本来源于临床疑似BS1患儿及其家系成员，通过标准化捕获建库流程完成高通量测序，并借助生物信息学工具筛选候选变异。Minigene系统基于pcDNA3.1载体构建，包含SLC12A1基因目标外显子及其侧翼内含子区域，用于模拟体内剪接过程。

研究结果
临床特征与初步诊断
患儿为32+4周早产女婴，出生体重1.65 kg，伴羊水过多、喂养困难及代谢性碱中毒。生化检测显示低钾血症（K⁺ 2.8 mmol/L）、肾素活性升高（PRA 12.5 ng/mL/h），肾脏超声提示髓质钙化灶，符合BS1典型表现。

基因变异鉴定
WES在SLC12A1基因发现杂合错义突变c.1391G > T（p.Gly464Val），但该变异在gnomAD数据库中频率为0.0002，不足以解释疾病表型。WGS进一步揭示深度内含子变异c.629-527 T > C（位于内含子4下游527 bp处），该位点未被常规分析工具识别。

功能验证
Minigene实验显示突变型载体转染后产生两种异常转录本：其一因内含子4保留导致移码突变p.Leu214IlefsTer31，另一与野生型相似。定量PCR证实突变型mRNA占比达45%，提示剪接效率显著降低。

研究结论
本研究首次报道SLC12A1基因深部内含子变异c.629-527 T > C通过干扰正常剪接引发BS1，扩展了该基因的突变图谱。研究表明，整合高通量测序与功能性验证技术可有效提升罕见病诊断率，对优化遗传咨询及个性化治疗具有重要指导意义。该发现亦提示临床需重视非编码区变异的潜在影响，尤其在涉及离子通道编码基因时更应全面评估基因组变异全景。

讨论延伸
当前BS1诊断仍面临挑战：约半数病例存在双等位基因突变检出困难，可能与深度内含子变异、拷贝数变异或调控元件异常相关³。本研究建立的minigene平台可作为筛查复杂剪接变异的高效工具，未来需结合长读长测序及三维基因组技术深入解析非编码区调控网络。此外，针对SLC12A1相关突变的药物研发（如NKCC2激动剂）可能成为改善肾小管功能的潜在策略。

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1. Simon DB et al., Nat Genet 1996;13(2):183-8.
2. Yi X et al., Front Pediatr 2022;10:876543.
3. Chen Y et al., Hum Mutat 2023;44(5):821-35.