基于长读长测序技术的FLG基因突变与拷贝数变异综合分析新策略

为解决FLG基因复杂突变和拷贝数变异(CNV)检测的技术瓶颈，研究人员开发了一种结合单重PCR与PacBio Sequel IIe长读长测序的创新方法。该方法成功鉴定了包括功能缺失突变在内的多种变异类型，并首次在东亚人群中发现7/20重复的罕见CNV等位基因，为皮肤屏障相关疾病的精准诊疗提供了新工具。

　　

皮肤作为人体第一道防线，其屏障功能的核心元件——聚丝蛋白(Filaggrin, FLG)的遗传变异与特应性皮炎、鱼鳞病等疾病密切相关。然而，FLG基因外显子3区域存在10-12个高度同源的重复序列，传统短读长测序技术难以准确解析其复杂变异。更棘手的是，不同人种中FLG拷贝数变异(CNV)的分布差异显著，东亚人群特有的12重复等位基因频率超50%，但现有检测方法对罕见CNV(如7/20重复)的识别能力不足，制约了皮肤疾病的精准风险评估。

为突破这一技术瓶颈，日本国立儿童健康与发展中心等机构的研究团队创新性地开发了"单重PCR-长读长测序"整合方案。研究人员从东京儿童健康队列(T-Child Study)中选取576份样本，通过设计带条形码的FLG特异性引物，仅需25ng DNA即可在单步PCR中完成文库制备，结合PacBio Sequel IIe平台实现单次运行检测400余样本。

关键技术包括：1) 基于UC Davis标准设计576种条形码引物；2) 使用KOD One Master Mix进行长片段PCR；3) PacBio HiFi reads经pbmm2比对和GATK HaplotypeCaller变异检测；4) 构建10/11/12重复等位基因特异性参考序列；5) 通过读长分布直方图判定CNV基因型。

研究结果部分：

1. 方法优化
   电泳显示单条>10kb扩增条带，75%样本成功扩增。测序数据中位数覆盖深度达2527×，可准确区分7-20重复的CNV等位基因。

2. CNV多样性
   发现5种CNV等位基因(A0-A7)，东亚人群特有的12重复(A3)占比54%，首次检出20重复(A7)罕见变异。通过IGV可视化确认A1_alt等位基因存在RPT8缺失的特殊结构。

3. 突变谱解析
   鉴定出11个功能缺失突变，包括日本人群已知的p.S2889X(1.71%)和新发现的p.S3675X等5个变异。Sanger测序验证显示c.3222_3225del等变异位于不同重复单元。

4. 跨种族比较
   CNV分布呈现明显种族差异：非洲人群以10重复为主(61.5%)，欧洲人群以11重复占优(51.5%)，而东亚人群12重复高达62.5%。

讨论指出，该方法相较既往两阶段PCR方案更高效经济，尤其适合大规模筛查。发现的20重复等位基因可能增强皮肤屏障功能，为环境暴露研究提供新线索。局限性在于外显子1-2未覆盖及部分样本扩增效率待提升。该成果发表于《Genomics》，为皮肤病精准医疗提供了重要技术支撑，未来可通过扩大种族样本进一步揭示FLG变异谱系与疾病关联。