蛋白质语言模型驱动的双结合基序PET水解酶理性设计及其固液界面催化机制解析

本研究针对PET塑料污染治理难题，创新性采用蛋白质语言模型(PLM) Evolutionary Scale Modeling-1V(ESM-1V)对祖先序列重建获得的ASR1-PETase进行智能化改造。通过筛选获得三重突变体ASR1-HRT(N81H/W120R/V265T)，其催化效率较FAST-PETase提升6.1倍，对商业PET塑料的最终解聚率达96.1%。分子动力学(MD)模拟揭示该酶通过两个PET结合基序增强固液界面吸附能力，为塑料生物降解提供了新型高效酶制剂和理论指导。

　　

塑料污染已成为全球性环境挑战，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为最常见的合成聚酯，年产量超过7000万吨，但传统机械回收方法存在能耗高、产物价值低等问题。生物催化降解因其环境友好特性被视为潜在解决方案，然而天然PET水解酶(PETase)普遍存在热稳定性差、催化效率低等瓶颈。虽然已有研究通过定向进化获得FAST-PETase等改良版本，但传统方法需要构建数千个突变体库，耗时耗力且缺乏理性设计依据。

针对这一难题，华东理工大学的研究团队创新性地将人工智能技术与酶工程相结合，利用蛋白质语言模型(Protein Language Model, PLM)对祖先序列重建(Ancestral Sequence Reconstruction, ASR)获得的ASR1-PETase进行智能化改造。研究通过ESM-1V模型筛选获得性能显著提升的三重突变体ASR1-HRT，并结合分子动力学模拟揭示了其高效催化机制，相关成果发表在《Green Carbon》期刊。

研究主要采用四种关键技术方法：1) 应用ESM-1V模型进行虚拟饱和突变库构建和有益突变预测；2) 定点突变构建20个候选变异体并进行酶活筛选；3) 采用GROMACS 2022.5软件进行100 ns全原子分子动力学模拟；4) 通过PLUMED 2.8.2实现增强采样模拟分析自由能变化。实验验证使用商业PET薄膜和消费后PET包装盒作为底物。

在"PLM应用于ASR1-PETase精细调控"部分，研究显示ESM-1V模型成功预测出20个潜在有益突变，其中ASR1-V265T、ASR1-N81H等四个单突变体在30-50°C均保持80%以上的BHET转化率。通过重组获得的ASR1-HRT三重突变体，其TPA产量较FAST-PETase提高6.06倍，展现出卓越的温度适应性。

"MD模拟解析ASR1变异体稳健性增强机制"部分揭示，ASR1-HRT的RMSD值(2.86-3.31 ?)显著低于野生型(9.11 ?)，内部氢键数量增加9个。溶剂化分析显示该变异体在60°C时活性位点水分子数量增加，反应距离(SG-C8)缩短至3.5 ?，自由能垒降低至69 kJ/mol，这些发现从原子层面解释了催化效率提升的结构基础。

"ASR1变异体实现高效PET薄膜解聚"实验证实，ASR1-HRT在60°C对商业PET的解聚率达96.06%，接触角从86.1°降至57.6°，表明其有效改善了材料表面润湿性。对比测试显示其性能优于DepoPETase等已知工程酶，展现出工业化应用潜力。

最具创新性的发现体现在"ASR1变异体的两个捕获钳增强PET表面结合亲和力"部分。MD模拟首次揭示ASR1酶序列首尾存在两个特征性捕获基序，通过π-π堆积和氢键网络(V1-A2-R7等残基)实现初始吸附。结合能计算显示ASR1-HRT(-826.3 kJ/mol)结合强度显著高于截短变体(-568.4 kJ/mol)，截断实验证实这两个基序是酶活性的必需元件。

该研究通过PLM指导的理性设计获得高性能PET水解酶ASR1-HRT，其创新价值体现在三方面：首先，将AI预测与实验验证相结合，仅筛选20个突变体即获得显著改良酶，大幅提高研发效率；其次，通过多尺度模拟揭示了温度稳定性增强的分子机制；最重要的是发现两个关键捕获基序，为理解酶-材料界面相互作用提供了新视角。这些发现不仅推动了塑料生物降解领域的发展，也为其他工业酶的智能化设计提供了范式。未来研究可进一步探索这些捕获基序在其他水解酶中的普适性应用，并优化大规模生产工艺以促进实际应用。