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该综述聚焦细胞外囊泡（EVs）在蛋白与肽类药物递送中的应用。阐述其作为新型递送系统的优势，如生物相容性、靶向性等，探讨工程化、表征技术及在癌症等疾病中的应用，分析挑战与前景，为相关领域提供参考。
细胞外囊泡作为蛋白质和肽类治疗药物递送载体的研究进展
引言
蛋白质和肽类治疗药物在治疗癌症、神经退行性疾病和代谢性疾病等方面具有巨大潜力，但存在快速降解、生物利用度低、半衰期短和早期清除等问题，限制了其临床应用。尽管已有多种修饰和递送系统（DDS）被测试，如酶抑制剂、化学修饰和传统纳米颗粒，但都存在免疫反应等局限性。细胞外囊泡（EVs）因其小尺寸、生物相容性、固有靶向能力、低免疫原性以及保护货物免受酶降解的能力，成为克服这些缺点的良好解决方案。在临床前研究中，EVs 在增强蛋白质 / 肽类货物的摄取、装载、渗透和靶向释放方面已显示出有希望的结果，可用于治疗癌症、糖尿病和微生物感染等疾病。此外，它们还可作为靶向肽的载体，实现合成药物和基因编辑工具的递送。
细胞外囊泡的特性和优势
EVs 可根据其形成方式、大小或功能分为外泌体（内吞起源）、微囊泡（质膜衍生）和凋亡小体（凋亡过程中形成）。外泌体是内体起源的囊泡（约 40-160 nm），通过质膜出芽形成，其内容物反映供体细胞的组成并受调控分选机制影响，由蛋白质、脂质和 RNA 组成，存在于多种体液中。微囊泡是 100-1000 nm 的囊泡，通过裂变从质膜释放到细胞外环境，其组成取决于起源细胞，脱落受脂质 - 蛋白质组成和钙离子调控。凋亡小体是细胞凋亡过程中产生的，直径 800-5000 nm，含有完整细胞器、染色质和一些糖基化蛋白质，可被巨噬细胞等清除并传递生物分子。
与传统人工纳米颗粒相比，天然来源的 EVs 是通用且高效的载体，具有闭环结构和表面特殊蛋白质表达，可防止货物在细胞外环境中过早释放和降解，继承了原始亲代细胞的靶向递送能力，能帮助货物克服生物屏障，如肿瘤血管，实现肿瘤组织中的有效聚集，且具有低生物毒性和良好的生物相容性。
细胞外囊泡的分离
选择合适的供体细胞和分离方法对于确保 EVs 有效携带治疗药物并靶向特定细胞至关重要。目前已开发出多种分离技术，包括超滤、共沉淀、尺寸排阻色谱、密度梯度超速离心、微流控装置、聚乙二醇（PEG）沉淀和免疫亲和捕获等。然而，这些技术存在变异性、囊泡降解、可扩展性低、纯度问题和资源需求高等挑战。由于没有单一方法能克服所有这些限制，因此选择取决于研究目的和方案。
用于蛋白质和肽递送的细胞外囊泡的工程化和装载
天然 EVs 存在靶向能力差的局限性，可通过工程化改造使其成为多种疾病细胞治疗的有希望来源。EV 工程化技术应使 EV 携带靶分子，同时允许用于所需治疗目的的靶向修饰。EVs 作为载体的应用取决于其有效的药物装载，但这仍是其功能化的一个挑战。当前方法包括超声处理、电穿孔、转染、孵育、挤压、皂苷辅助装载、转基因、冻融循环、热激、pH 梯度和低渗透析等。货物的装载可分为内源性装载和外源性装载。内源性装载通过修饰供体细胞使其产生携带靶分子的 EVs，保留膜完整性但无法控制药物装载；外源性装载则在分离 EVs 后使用多种技术将货物装载到膜上或内部，适合大规模生产但可能破坏膜结构，导致 EV 聚集或裂解。
细胞外囊泡及囊泡 - 货物复合物的表征
尽管一些 EV 制剂已进入体内使用和临床试验，但仍存在关键问题，如化合物与 EVs（尤其是外泌体）结合的选择性、相互作用模式和装载化学计量、对囊泡性质和功能的影响以及这些制剂在生物流体中的稳定性等。随着对 EVs 在细胞间通信中的作用及其在（生物）医学应用中的诊断、预后和治疗潜力的兴趣日益增长，需要准确评估其生化和物理特性。有多种 EV 表征方法，包括传统方法和新兴方法，选择时需考虑分离和纯化方法，可单独使用或组合使用，每种技术都有其优缺点。
细胞外囊泡的吸收、摄取和释放
EVs 释放到细胞外空间后与细胞相互作用的具体机制可能取决于所涉及的细胞类型、外泌体表面的分子以及受体细胞表面存在的分子。外泌体到达受体细胞后，可通过内吞作用、直接与质膜融合或与细胞表面受体相互作用，启动细胞内信号通路。内吞作用后，外泌体可与内体膜融合，将内容物释放到细胞质中；也可直接与受体细胞质膜融合，将内容物直接释放到细胞质中，直接融合是将货物递送到细胞内最有效的途径。货物进入细胞后，外泌体的内容物（包括蛋白质、脂质、RNA 和药物）可影响受体细胞的功能，包括基因表达变化、信号通路改变和免疫反应诱导等，但不同细胞类型的可变性给基于外泌体的药物递送系统的临床应用带来了重大挑战。
细胞外囊泡在蛋白质和肽递送中的应用
蛋白质和肽类药物具有巨大的治疗潜力，但其递送和稳定性限制了临床应用。口服给药因简单、经济和患者依从性好而受到青睐，但存在酶降解和上皮渗透差等挑战。EVs 作为载体在蛋白质和肽递送中具有重要作用，可用于递送治疗性重组蛋白、单克隆抗体、抗菌肽（AMPs）、激素等，通过工程化改造可实现靶向递送，提高治疗效果并减少副作用。例如，在癌症治疗中，工程化 EVs 可靶向肿瘤细胞，增强药物的摄取和抗肿瘤效果；在感染性疾病中，EVs 可递送 AMPs，增强抗菌活性；在心血管疾病中，EVs 可靶向缺血心肌，减轻炎症和凋亡，促进血管生成和心脏功能恢复。
基于细胞外囊泡的临床试验的最新进展
近二十年来，基于 EVs 的临床试验在诊断和治疗中的作用日益增长。目前，超过 100 种基于细胞外囊泡（EVs）的产品正在进行临床试验，主要针对包括癌症和 COVID-19 在内的各种疾病。关键试验类别包括使用间充质干细胞衍生的 EVs 治疗急性呼吸窘迫综合征和非小细胞肺癌等疾病。尽管一些试验已完成阶段并报告了有希望的结果，但许多研究仍在进行中，结果尚未公布。在标准化和监管批准方面仍存在挑战，这可能会影响基于 EVs 的疗法的整体临床转化速度。
挑战与未来展望
与传统或合成纳米载体相比，EVs 具有固有生物相容性、靶向能力、低免疫原性和无毒性等优点。然而，作为药物递送载体，EVs 的应用在大规模生产、药物装载、表征和工程化等基本技术方面仍受到限制。EVs 的高效生产和分离在临床规模上仍然具有挑战性，包括保持批次一致性和纯度、平衡产量和纯度、确定最佳储存条件以及满足监管要求等。由于表征和分离缺乏标准化，EV 基产品面临监管批准挑战，其生物学性质带来了不同的监管要求，异质性和不完全的机制理解阻碍了一致的结果，潜在的致癌转移和 EV 货物含量的可变性等安全问题进一步 complicate 诊断测定的开发。未来，需要通过监管要求和国际良好实践指南来解决这些挑战，确保再现性、可靠性和成功的临床转化。此外，基因编辑工具如 CRISPR/Cas9 可用于增强 EVs 的功能化，以实现靶向蛋白质和肽递送，人工智能（AI）算法可用于 EV 表征的数据分析，克服主观性和偏见。
结论
细胞外囊泡（EVs）为递送蛋白质和肽类治疗药物提供了一个有前途的平台，解决了传统递送系统（合成纳米颗粒、粘液粘附剂和酶抑制剂）的局限性。它们可从各种来源分离，使用多种方法进行有效装载，并通过先进技术进行表征。临床前研究表明，EV - 蛋白质 / 肽复合物在治疗糖尿病、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、急性肺损伤、心肌梗死和微生物感染等疾病方面具有良好的效果，还可携带靶向肽用于递送其他合成抗癌药物和靶向基因编辑。进一步研究优化 EV 工程和表征并克服当前挑战，可推动基于 EV 的蛋白质和肽治疗药物递送的发展。尽管已完成和正在进行的几项基于 EV 的临床试验报告了有希望的结果，但由于标准化和监管批准，挑战仍然存在。
