多通道单分子FRET技术揭示核糖体上EF-G的紧凑构象及其在蛋白质合成调控中的机制

研究人员针对EF-G在核糖体移位中的作用机制不明确的问题，利用多通道单分子FRET（smFRET）技术，研究了EF-G的构象变化与tRNA移位的关系。发现T48E/T48V突变导致EF-G形成独特的紧凑构象，阻碍多聚苯丙氨酸（Poly(Phe)）合成，为理解人类eEF2磷酸化抑制蛋白质合成的机制提供了新线索。

　　

在细胞中，蛋白质的合成是一个高度精细且耗能的过程，而核糖体作为蛋白质合成的“工厂”，其移位的准确性直接决定了翻译的效率。延伸因子G（EF-G）是这一过程中的关键“马达蛋白”，通过水解GTP（三磷酸鸟苷）为核糖体沿mRNA的移动提供能量。然而，EF-G的GTP水解如何精确调控其构象变化以促进tRNA移位，一直是领域内的未解之谜。此外，人类真核延伸因子2（eEF2）在Thr56位点的磷酸化会全局抑制蛋白质合成，但其分子机制尚不明确。这些问题的解答不仅对理解基础生物学过程至关重要，还可能为相关疾病的治疗提供新靶点。

为了解决这些问题，中国的研究团队在《The International Journal of Biochemistry》上发表了一项研究。他们开发了一种创新的多通道单分子FRET（smFRET）技术，能够同时监测EF-G的构象变化和tRNA在核糖体上的移位过程。通过构建双荧光标记的EF-G（M5变体）和核糖体复合物，结合T48E/T48V突变模拟eEF2的磷酸化效应，研究人员揭示了EF-G在核糖体上的动态构象与功能的关系。

关键技术方法包括：1）多通道smFRET显微镜系统，通过双激光激发和双摄像头同步采集EF-G（Alexa488/594标记）和tRNA-核糖体（Cy3/Cy5标记）的FRET信号；2）体外翻译系统（Poly(Phe)合成实验）评估EF-G突变体的功能；3）共沉降实验分析EF-G与核糖体的结合能力；4）结构比对和序列分析定位关键功能位点。

研究结果分为以下几个部分：

3.1. 多通道单分子FRET（smFRET）仪器
通过双FRET对设计，研究人员首次实现了对EF-G构象（F410C-Y533C标记）和tRNA移位（L27-tRNA^Phe标记）的同步观测。结果显示，野生型EF-G在结合核糖体后构象扩展，而T48E/T48V突变体则形成更紧凑的构象。

3.2. 不同核苷酸状态下M5催化的移位
实验发现，EF-G•GTP和EF-G•GDPCP均可促进tRNA移位，但EF-G•GDP在存在梭链孢酸（Fus）时效率显著降低，表明GTP水解后的构象变化对功能至关重要。

3.3. EF-G开关I区的突变分析
T48位于EF-G的开关I区，与人类eEF2的Thr56同源。突变体T48E（模拟磷酸化）和T48V虽保留GTP水解能力，但导致Poly(Phe)合成几乎完全抑制，且与核糖体结合后形成异常紧凑构象。

3.4. 核糖体对EF-G构象的调控
SRL（核糖体GTP酶激活中心）单独作用可诱导EF-G构象扩展，但完整核糖体结合T48E/T48V后，EF-G被“锁定”在紧凑状态，无法促进tRNA移位。

3.5. 突变体的酶学功能验证
共沉降实验表明，T48V因结合核糖体后难以解离而丧失功能，而T48E虽能结合并水解GTP，但无法完成移位，与磷酸化eEF2的表型一致。

研究结论指出，EF-G的开关I区（尤其是T48）通过调控构象变化决定其功能活性。T48E/T48V突变模拟了eEF2磷酸化的效应，揭示了紧凑构象可能是翻译抑制的结构基础。这一发现不仅阐明了EF-G在移位中的变构机制，还为理解eEF2相关疾病（如神经退行性疾病和癌症）的分子病理提供了新视角。此外，多通道smFRET技术的成功应用，为研究其他大分子机器的动态过程提供了范式。

讨论部分强调，该研究首次捕捉到EF-G在核糖体上的紧凑构象，并证明其与功能失活的直接关联。未来需进一步解析这一构象的精确结构，并探索其在生理条件下的调控意义。对eEF2磷酸化机制的类比，也为开发靶向翻译调控的药物开辟了新思路。