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该综述聚焦原子力显微镜（AFM）在口腔细菌粘附研究中的应用，系统分析 24 项体外研究，揭示口腔细菌在 12 类生物材料表面的粘附特性，涉及变形链球菌（S. mutans）等菌种，总结最大粘附力、粘附能等参数，为口腔疾病防治提供理论依据。
1. 引言
龋齿和牙周病是全球高发的口腔疾病，约 34.7 亿例，其发生与牙齿表面复杂的微生物生物膜密切相关。生物膜形成始于细菌对表面的粘附，因此研究细菌与组织及生物材料的粘附特性对防治口腔疾病至关重要。
传统研究细菌粘附的技术如基于微生物学的测定和电子、荧光显微镜检查存在诸多局限性，如难以区分粘附与非粘附细菌、灵敏度有限等。原子力显微镜（AFM）作为一种先进的非侵入式显微镜技术，可在接近生理条件下实时表征样品的地形和机械特性，在牙科领域已用于研究细菌对生物材料、细胞、组织等的粘附。常见的 AFM 技术包括细菌力谱法，可在不破坏细菌的情况下固定单个细菌并实时探测其粘附特性。
尽管 AFM 和细菌力谱法在探索口腔细菌粘附的机械生物学方面应用日益增多，但缺乏系统总结这些方法在牙科研究中应用的科学证据的报道。因此，本系统综述旨在评估使用 AFM 进行的体外研究中关于口腔细菌粘附的现有证据，研究问题为 “AFM 实验后报告了哪些口腔细菌附着于表面的粘附参数？”
2. 材料与方法
2.1 数据库和搜索策略
本系统综述遵循系统评价和 Meta 分析的首选报告项目（PRISMA）指南，搜索方案在开放科学基金会（OSF）平台注册。采用 PICO 策略制定研究问题（人群：口腔细菌；干预：基于 AFM 的粘附实验；比较：无；结果：任何报告的粘附参数）。于 2023 年 10 月最后一次访问 PubMed、Web of Science 和 SCOPUS 数据库，使用为每个数据库专门设计的搜索策略。纳入报告基于 AFM 的口腔细菌粘附实验体外结果的英文原创文章，排除仅使用 AFM 进行表面分析而未报告粘附参数的文章、使用患者来源的组织或唾液的研究、综述和观点文章以及无法获取全文进行分析的文章。
2.2 研究选择和数据提取
研究选择和数据提取由两名研究人员（AO 和 VB）独立进行，若存在分歧，由第三名研究人员（SA）解决。初步搜索识别并筛选了 249 篇文章摘要，去除重复记录（106 篇）和与研究问题无关的论文（91 篇）后，52 篇文章被纳入完整评估。从每篇文章中提取的信息包括标题、作者、DOI、期刊名称、出版年份、主要目的、口腔细菌类型、表面类型、AFM 粘附结果和主要研究结论，所有这些参数均使用定制的预先设计的 Excel 电子表格进行制表和总结。
在对这 52 篇文章进行深入分析后，由于与先前确定的纳入和排除标准相关的 10 个原因，进一步排除了 28 篇，这些原因包括使用唾液的实验、使用非口腔细菌的实验、使用患者来源的细胞或组织的实验、使用 AFM 进行表面粗糙度和地形分析而非细菌粘附的实验、使用细菌衍生物或生物膜而非细胞的实验等。最终，24 篇文章被纳入完整评估并在本综述中呈现。
3. 结果
文献中报道了 12 种不同的表面作为口腔细菌 AFM 粘附实验的底物，包括软材料（胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白）、修复牙科材料（如钛和树脂等临床相关生物材料）和其他材料（如玻璃、聚苯乙烯）。其他材料如玻璃、聚苯乙烯或裸露的 AFM 尖端用于实验，是因为它们允许研究影响粘附的一般底物因素，如疏水性、附着时间、地形和环境条件，这些因素可转移到口腔生物材料。牙科和软材料则主要用于探索相关口腔微生物在接近体内情况的条件下的粘附行为，在某些情况下，还与细菌组织侵袭或种植体周围炎等生理或病理条件相关。
关于细菌菌株，变形链球菌（S. mutans）是研究最多的微生物，研究探讨了其对胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃离子聚合物、复合材料、氧化锆和羟基磷灰石等相关生物和生物材料表面的粘附。在较小程度上，AFM 衍生实验也研究了其他相关的早期和晚期定植口腔微生物的实时粘附，如血链球菌（Strepcococcus sanguinis）、口腔链球菌（Streptococcus oralis）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）。
从实验角度来看，已发表的方案要么涉及用细菌功能化 AFM 探针以检查其对感兴趣底物的粘附，要么将活细菌固定在底物上并用裸露或涂层的 AFM 尖端进行探测。从这些实验中，最常报告的基于 AFM 的粘附参数是细菌和底物之间的最大粘附力。对于口腔细菌，报道的最大粘附力范围从高皮牛（pN）到低纳牛（nN）值。还显示了其他相关值，如粘附能（也称为粘附功）、次要解链力、破裂或脱离长度、解链事件总数和轮廓长度。此外，所有探索接触时间对粘附作用的研究都得出结论，接触时间越长，细菌和表面之间的附着力越高。除接触时间外，实验变量如缓冲液类型、接触力和探测速度也有报道，且大多对粘附结果有影响。
表面组成和所用微生物菌株类型的变化也观察到显著的粘附差异。例如，Schuh 等人和 Leiva-Sabadini 等人发现，糖基化增加了变形链球菌对 I 型胶原表面的粘附，但不增加血链球菌的粘附。González-Benito 等人表明，将 TiO?掺入牙科树脂中增加了与变形链球菌附着相关的粘附力和破裂长度。Dhall 等人观察到相反的效果，当钛酸钡添加到复合材料中时，它降低了细菌的附着力。表面粗糙度也被发现促进变形链球菌对氧化锆的粘附。关于细菌细胞差异，Wang 等人证明，与糖基转移酶（Gtfs）产生相关的 gtfB 和 gtfC 基因的缺失导致变形链球菌对玻璃离子聚合物和牙科复合生物材料的粘附减少。其他相关基因如 wapA、spaP 和 luxS 的缺失也被发现改变变形链球菌对氮化硅、层粘连蛋白和玻璃的粘附。最后，值得一提的是，羟基磷灰石表面的氟预处理减少了肉链球菌（S. carnosus）、口腔链球菌和变形链球菌的早期粘附。同样，发现精氨酸的使用抑制了变形链球菌的早期粘附以及细菌细胞和表面之间观察到的较长破裂长度。
4. 讨论
从现有结果可以得出，有许多关键的生物学参数影响口腔细菌在底物上的粘附。其中，细菌和表面之间较长的接触时间（也称为停留时间）导致用 AFM 探测时粘附力增加，这可以通过键强化过程来解释，即细菌可以随时间重新排列其膜或细胞壁成分以优化表面附着，这在涉及非口腔微生物的 AFM 实验中也有观察到。这种特性在临床上具有相关性，例如在龈沟液或唾液流量减少的患者中，因为这是一种可以从表面去除细菌的基本保护过程。
此外，介导早期细菌附着的最重要分子之一是粘附素，这是一类表面受体，能够通过物理化学和生物相互作用的组合感知表面并粘附。一些与口腔生物材料和组织定植相关的重要细菌粘附素包括胶原蛋白结合蛋白，如 SpaP、WapA、Gtfs 和表面粘附蛋白 FimA。因此，使用感兴趣的粘附素（或其他分子）缺陷的突变株是理解细菌粘附背后机制的常用方法，在所有这些情况下，用 AFM 探测时，感兴趣的粘附素或 Gtfs 的缺失导致测量的粘附力降低。
尽管 AFM 细菌粘附实验是一种纯体外方法，但它可以提供关于控制口腔细菌对组织粘附的临床参数的重要知识。例如，有趣的是，早期口腔定植者对口腔中的一系列天然和人工表面表现出更高的亲和力，这表明早期口腔定植者，尤其是口腔链球菌，已经进化出多种机制，使其即使在没有唾液薄膜的情况下也能与宿主相互作用。此外，涉及口腔细菌对软生物材料粘附的 AFM 测定通常比硬表面或材料产生更低的实验粘附参数，这可能是由于表面 - 细菌结合过程中的底物顺应性，导致实验期间分子相互作用的数量减少。其他可临床推断的调节细菌附着的变量包括表面粗糙度、表面糖基化、氟的存在和防污剂的存在。然而，需要进一步的研究来检查这些参数对早期细菌粘附的影响是否也转移到生物膜成熟水平，以及是否与口腔疾病相关的生物膜失调的促进或抑制有关。
在研究最多的细菌中，变形链球菌，尤其是 UA 159 菌株对表面的粘附是 AFM 实验中最常用的体外模型，一种可能的解释是其基因组已完全测序，因此允许将粘附实验与其他生物和分子结果相关联。总体而言，变形链球菌是与龋齿相关的研究最多的微生物之一，因此其对生物和人工表面的粘附已在多篇已发表的报告中进行了探讨，它还与远程组织侵袭和定植有关，这尤其与其胶原蛋白结合特性有关。另一方面，早期定植者如血链球菌和口腔链球菌对钛底物的定植已在牙科种植体生物膜形成的背景下进行了探索，以及与生物膜失调和种植体周围组织破坏密切相关的致病性牙龈卟啉单胞菌的粘附。因此，基于 AFM 的实验对于理解生物摩擦腐蚀在种植体周围生理病理学中的作用以及寻找可以抑制该背景下生物膜形成的新型表面配置和分子具有高度相关性。
从实验角度来看，理解每篇论文中报道的 AFM 粘附参数仍然很重要。例如，最常用的测量是最大粘附力，它反映了细菌细胞和表面之间最强的相互作用点，对于口腔细菌，结果一致显示最大粘附力在 nN 和 pN 范围内，类似于涉及其他细菌的 AFM 实验。然而，也可以评估粘附功，它描绘了整个解链过程中的整体细胞 - 表面相互作用，因此，当细胞探针和底物之间存在许多次要的分子表面相互作用时，粘附能是理解整体粘附过程最可靠的参数。总体而言，粘附力和粘附能测量都可以在 AFM 文献中找到，一些报告同时提供最大粘附力和能量。还可以找到代表细胞或受体从表面脱离距离的破裂长度和轮廓长度的值，总体而言，较长的相互作用距离表明细菌和表面之间更强的粘附相互作用，或细胞成分（如细胞膜或粘附素）的拉伸以及表面的机械性能。最后，当存在分子相互作用时（主要以力 - 距离曲线中的 “锯齿” 模式形式），还可以量化参与底物结合的粘附素的特定粘附力，总之，这一系列粘附参数可以描绘细菌在细胞和亚细胞水平上对表面粘附的动态。
另一方面，有几个实验设置会影响基于 AFM 的粘附实验的数据。理想情况下，所有涉及细菌的粘附实验都应在缓冲条件下而非空气中进行，以维持细菌活力并在生物学上与体内细菌 - 底物相互作用具有可比性。此外，理想情况下，选择具有降低的弹簧常数（~0.01–0.1 N/m）的软 AFM 悬臂，以便能够检测细胞和亚细胞范围（nN 至 pN）的粘附力。在实验过程中，通常也更倾向于选择力谱法而非动态模式来量化细菌粘附参数并精确控制力的应用。正如在分析的研究中所观察到的，细菌可以通过实验固定在 AFM 尖端或底物上以探测其粘附行为，这将取决于诸如所评估的特定生物学问题、微生物的细胞形态和技术能力等因素。总体而言，这些参数对于确保 AFM 关于口腔细菌对生物材料粘附的发现的可重复性和生物学意义至关重要。
与其他体外研究一样，讨论本综述中包括的主要论文时必须考虑一些局限性。首先，AFM 实验是体外实验，尽管在接近生理条件下进行，但可能无法指示细菌在某些体内情况下的有效附着，口腔是一个高度复杂和多变量的生态位，很难完全转化为实验室环境。此外，由于 AFM 是一种非常灵敏的技术，实验设置中多个变量的存在（如患者来源的标本或唾液）会使结果的标准化和可重复性变得困难。因此，与真实的口腔环境相比，口腔细菌对相关表面的粘附研究通常以 “简化” 的方式进行，例如使用稳定生理温度下的生理缓冲液。然而，AFM 细菌光谱可以产生关于口腔细菌在细胞和分子水平上粘附的可量化数据，这是大多数其他显微镜技术和微生物测定无法获得的。总之，使用 AFM 进行的活细胞细菌粘附实验可以探索口腔细菌表面定植的动态，并为如何开发针对口腔生物膜介导疾病的生物膜形成的新方法提供新知识，这些知识应考虑用于设计新分子和口腔生物材料，以选择性地减少细菌粘附，从而降低口腔中生物膜介导疾病的发生概率。
5. 结论
本综述强调了 AFM 在研究活的口腔细菌在临床感兴趣的组织和生物材料上的实时粘附方面的当前应用。纳入的研究表明，细菌附着受细胞 - 表面接触时间、表面粗糙度和防污性能、细菌菌株类型、糖基化以及氟的存在与否的调节。当前的抗菌方法在设计分子和表面以对抗口腔生物膜形成和预防口腔疾病的发展时，应考虑这些变量。
