热化学抗体剥离方法优化：提升脆弱组织中酪胺信号放大-蛋白石多重免疫组化的应用效能

为解决多重免疫组化(mIHC)中抗体剥离不彻底导致的信号交叉反应问题，北京大学第三医院团队优化了基于杂交炉的热化学抗体剥离方法(HO-AR-98)。研究发现98℃杂交炉处理在保持组织完整性的同时，可完全去除抗体复合物，成功实现脑组织等脆弱样本的五色mIHC检测。该成果为肿瘤微环境(TME)研究提供了更可靠的技术方案，发表于《BMC Research Notes》。

　　

在生命科学和临床诊断领域，多重免疫组化(multiplex immunohistochemistry, mIHC)技术正成为解析肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)细胞空间关系的利器。其中，基于酪胺信号放大(tyramide signal amplification, TSA)的蛋白石(Opal)系统可通过"染色-剥离"循环实现单张切片6-8种蛋白标记，但现有抗体剥离方法存在明显局限：微波处理(MO-AR)易导致脆弱组织脱落，而化学试剂(CR-AR)的剥离效果受温度、pH等因素影响显著。特别是在脑组织等易分层样本中，这些缺陷严重制约了技术的推广应用。

针对这一技术瓶颈，北京大学第三医院的研究团队在《BMC Research Notes》发表论文，系统比较了四种抗体剥离策略。通过建立新型热化学处理流程，研究人员成功解决了传统方法在组织完整性与剥离效率之间的矛盾，为复杂组织的多靶标检测提供了标准化方案。

研究采用微波辅助抗体剥离(MO-AR)、化学试剂剥离(CR-AR)以及50℃/98℃杂交炉剥离(HO-AR-50/HO-AR-98)四种策略。关键技术包括：(1)使用小鼠肾脏和脑组织建立评估体系；(2)通过单色Opal检测验证抗体特异性；(3)设计双重荧光标记方案定量评估抗体复合物去除效率；(4)开发基于ImageJ的组织完整性量化算法；(5)采用Vectra Polaris系统进行多光谱成像分析。

不同抗体剥离策略的比较
通过CD31和ACE2标记实验发现，MO-AR和HO-AR-98能完全清除抗体复合物（Cy5通道信号强度与阴性对照无差异），而CR-AR和HO-AR-50存在显著残留信号。值得注意的是，HO-AR-98处理的脑组织缺失面积比MO-AR减少68%（P<0.001），证明高温杂交炉处理在保证剥离效果的同时，更利于维持组织结构。

新型热化学流程的建立
在肾脏五色mIHC中，HO-AR-98与MO-AR的标记一致性极高（CD31和Epcam的Pearson相关系数>0.92）。更重要的是，该方案成功应用于易脱落的脑组织，实现CD31/GFAP/Iba1/NeuN/DAPI五重标记，各靶点信号特异性达100%，且无交叉反应。

组织完整性评估
定量分析显示，经四次HO-AR-98循环的脑切片，其组织缺失面积仅为MO-AR处理的31%（P<0.001）。H&E染色对照证实，高温杂交炉处理能有效避免微波导致的组织碎裂现象，这对长期保存的临床样本尤为重要。

这项研究确立了热化学抗体剥离在TSA-mIHC中的关键优势：98℃杂交炉处理(HO-AR-98)通过精确控温，在彻底去除抗体复合物的同时，最大程度保护了组织形态学特征。相较于传统微波法，新方案使脑组织等脆弱样本的可用率提升3倍以上，为肿瘤免疫微环境的空间解析提供了可靠技术支撑。值得注意的是，该方法仅需常规实验室设备即可实施，具有显著的临床转化潜力。未来研究可进一步拓展其在循环肿瘤细胞(CTC)检测和免疫治疗疗效预测中的应用价值。