Stargardt 病（STGD）是一种主要由 ABCA4 基因突变引起的遗传性视网膜变性疾病，建立患者来源的视网膜类器官并进行单细胞 RNA 测序研究具有重要意义 —— 来自携带 ABCA4 突变的 Stargardt 病患者视网膜类器官的纵向单细胞 RNA 测序研究

推荐 为解决小鼠模型因缺乏黄斑难以模拟 STGD 特征的问题，研究人员利用携带 ABCA4 突变的患者 iPSC 生成视网膜类器官（ROs），进行多阶段 scRNA-seq 并与对照比较。结果揭示 ABCA4 突变导致光感受器细胞转录异质性，为 STGD 研究和药物发现提供新资源。

　　

论文解读

在人类的视觉世界里，视网膜如同精密相机的底片，而黄斑则是这张底片的核心区域，承担着精细视觉的重任。然而，Stargardt 病（STGD）如同潜伏在视网膜中的 “无形杀手”，正悄然侵蚀着人们的光明。这种主要由 ABCA4 基因突变引发的遗传性视网膜变性疾病，是导致青少年失明的重要原因之一。ABCA4 基因编码的转运蛋白本应肩负起清除光感受器细胞内有毒双视黄醛的重任，但其功能一旦因突变受损，有毒代谢物便会如同决堤的洪水般在细胞内堆积，引发视网膜的进行性退化。

目前，尽管科研人员已构建了多种携带致病突变的小鼠模型，但这些模型始终存在一个致命缺陷 —— 缺乏人类视网膜特有的黄斑结构，而黄斑恰恰是 STGD 病理变化的主要发生地。此外，小鼠模型中 ABCA4 错义突变所表现出的蛋白表达和定位模式，与人类的病理生理过程存在显著差异，这使得传统动物模型在模拟人类疾病特征方面力不从心。因此，开发能够真实反映人类遗传背景的新型疾病模型，成为破解 STGD 发病机制、推动靶向治疗的关键瓶颈。

为了突破这一困境，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的研究团队开展了一项具有开创性的研究。他们从一位携带中国人群中最常见 ABCA4 突变（Asn965Ser/Arg18Pro）的 STGD1 患者体内提取外周血单个核细胞（PBMCs），通过重编程技术将其转化为诱导多能干细胞（iPSCs），并进一步诱导生成视网膜类器官（ROs）。借助单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，研究人员对 ROs 在多个关键发育阶段（40、90、150、200 和 260 天）的转录组动态进行了深入解析，并与已发表的对照数据进行对比。这项研究成果发表在《Scientific Data》上，为 STGD 的研究提供了全新的视角和宝贵的数据资源。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过 Ficoll 密度梯度离心法从患者血液中分离 PBMCs，并利用 CytoTune?仙台病毒重编程试剂盒将其转化为 iPSCs，经碱性磷酸酶染色、核型分析等一系列严格的质量控制，确保 iPSCs 的多能性和遗传稳定性。随后，采用改良的三维培养方案，将 iPSCs 诱导分化为视网膜类器官，该过程历经神经诱导、视网膜分化和成熟等阶段，通过添加特定的细胞因子（如 BMP4、全反式视黄酸）和培养基（如 NIM、RDM、3D-RDM），模拟体内视网膜的发育环境。在单细胞测序环节，利用 10X Chromium 平台对不同发育阶段的 ROs 进行单细胞悬液制备和文库构建，并通过 Illumina NovaSeq 6000 进行高通量测序。数据分析则借助 Seurat 等生物信息学工具，完成数据质控、细胞聚类、细胞类型注释及差异表达基因分析等流程。

视网膜类器官的形态学验证与细胞类型鉴定

通过形态学观察和免疫荧光染色，研究人员证实所构建的 ROs 能够重现人类视网膜发育的关键阶段。在发育初期（40 天），ROs 呈现连续的亮相位外神经上皮边缘；随着时间推移（90 天），中央形成暗相位核心，外边缘逐渐变薄；至 150 天和 200 天，ROs 表面出现特征性的毛状突起，类似天然视网膜的结构。免疫染色结果显示，ROs 中存在多种视网膜特异性细胞类型，包括视网膜神经节细胞（RGCs，标记物 HuC/D）、光感受器前体细胞（CRX）、增殖祖细胞（Ki67、Chx10）、视锥细胞（ARR3）和视杆细胞（NRL）等，表明 ROs 成功模拟了视网膜的细胞多样性。

单细胞 RNA 测序数据质量控制

scRNA-seq 数据质量评估显示，各样本测序深度均超过 3 亿 reads，有效条形码率达 97.1%-98.5%，UMI Q30 碱基比例为 93.4%-96.7%，基因组映射率在 92.8%-94.1% 之间，表明数据具有较高的可靠性。细胞层面的质控结果显示，过滤后各时间点细胞数为 5360-10677 个，单个细胞检测到的基因中位数为 3349-4000 个，UMI 计数中位数为 7050-9622，数据离散度和技术变异均控制在合理范围内。

细胞类型组成与发育轨迹分析

通过无监督聚类和 UMAP 降维分析，研究人员在 ROs 中鉴定出 14 个 distinct 细胞簇，涵盖视网膜祖细胞（RPCs，标记物 SFRP2、FOXP1）、光感受器前体细胞（OTX2、PRDM1）、RGCs（GAP43、SNCG）、无长突细胞（ACs，TFAP2A、PTF1A）、水平细胞（HCs，ONECUT2、ONECUT3）、视杆细胞（NRL、PDE6A）、视锥细胞（PDE6H、THRB）等主要视网膜细胞类型。细胞组成动态分析显示，在发育早期（40 天），ROs 主要由 RPCs 组成；随着发育进程（90-150 天），神经节细胞、无长突细胞和光感受器前体细胞逐渐出现；至 200-260 天，视杆和视锥细胞成为主导细胞类型，体现了视网膜从增殖到分化的有序发育过程。

ABCA4 突变对光感受器细胞的影响

与对照 ROs 相比，携带 ABCA4 突变的 ROs 表现出显著的形态学异常。免疫荧光染色显示，突变 ROs 中的视锥细胞数量明显减少，其外段（OS）标记物 L/M-opsin 的表达强度降低，而内段（IS）标记物 HSP60 的分布无显著差异，提示突变主要影响视锥细胞的外段结构。此外，连接纤毛（CC）标记物 ARL13B 在突变 ROs 中的定位呈现异常的点状分布，而非对照组中典型的 “马蹄铁” 形，表明 ABCA4 突变可能破坏了视锥细胞连接纤毛的完整性，进而影响其功能。

单细胞转录组分析揭示，ABCA4 突变导致光感受器细胞内多个关键通路的基因表达发生显著改变。差异表达基因分析显示，突变组中光转导通路（如 PDE6H、GNAT2）、视黄醛代谢通路（如 RDH5、ALDH1A3）及纤毛组装相关基因（如 CCDC66、TTC21B）的表达水平均显著下调，而应激反应相关基因（如 HSPA1A、DDIT3）和炎症相关基因（如 IL6、CXCL8）的表达则显著上调。这些结果表明，ABCA4 突变通过干扰光感受器细胞的能量代谢、信号传导和结构稳定性，引发细胞内应激和炎症反应，最终导致视网膜变性。

这项研究首次利用患者来源的 iPSC-derived 视网膜类器官和单细胞转录组技术，系统解析了 ABCA4 突变在 STGD 发病中的分子机制。研究不仅成功构建了能够模拟人类黄斑发育特征的疾病模型，弥补了传统动物模型的不足，还揭示了光感受器细胞在 ABCA4 突变背景下的转录异质性，为深入理解 STGD 的病理进程提供了单细胞层面的证据。此外，该研究建立的长期培养 ROs 体系和公开的单细胞数据集（NCBI SRA accession: SRP554832），为后续开展 STGD 致病机制研究、药物筛选及基因治疗评估提供了重要的资源和技术平台。值得注意的是，研究中发现的视锥细胞结构异常和纤毛功能缺陷，提示靶向光感受器细胞外段和连接纤毛的修复可能成为 STGD 治疗的新方向。未来，结合基因编辑技术（如 CRISPR-Cas9）和 ROs 模型，有望进一步揭示 ABCA4 突变的致病亚型特异性机制，推动 STGD 个性化治疗的发展。