利用Tol2转座酶介导整合亚基分裂载体在CHO细胞中生产多亚基蛋白

推荐 为解决CHO细胞生产重组蛋白时基因拷贝数优化难题，本研究团队开展转座酶介导整合亚基分裂载体研究。结果表明，该方法能建立高产细胞系，无需预先调整拷贝数，且细胞系稳定性良好。此成果为生物制药生产提供了新途径。

　　

论文解读
在当今生物制药领域，重组蛋白的生产至关重要。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系作为生产治疗性蛋白的常用系统，虽具备能产生具人类相似翻译后修饰蛋白以及可在无血清悬浮培养中大规模培养等优势，但在基因引入及提高基因表达方面仍面临诸多挑战。传统随机整合方法难以精准控制基因插入位置，而新兴的位点特异性重组酶介导的盒交换（RMCE）技术和CRISPR/Cas9系统虽可实现特定基因座位的靶向整合，却也存在寻找合适靶点困难，影响重组细胞系基因表达增强的问题^[10]。基于此，Kyowa Kirin Co., Ltd的研究人员开展了利用Tol2转座酶介导整合亚基分裂载体在CHO细胞中生产多亚基蛋白的研究。

研究人员首先构建了携带单克隆抗体（mAb）重链（HC）和轻链（LC）基因的单个转座子载体，分别构建了含环己酰亚胺（CHX）抗性基因和mAb - A或mAb - B的HC基因的pT2HC(A) - CHX、pT2HC(B) - CHX载体，以及含新霉素抗性基因和相应LC基因的pT2LC(A) - Neo、pT2LC(B) - Neo载体，同时构建含Tol2转座酶基因的pKT2TP转座酶表达载体^[Fig.1]。将上述载体转染到悬浮CHO细胞中，通过CHX抗性筛选，成功获得高产细胞池，并进一步筛选出高产克隆细胞系。结果显示，不同mAb细胞系中HC和LC构建体的拷贝数存在差异，且在长期培养过程中，细胞系能保持稳定的抗体生产力、细胞生长以及拷贝数^{[Fig.2][Fig.3][Fig.4][Fig.5]}。

在研究方法上，主要采用了转座酶介导的基因整合技术，利用Tol2转座子将目的基因整合到宿主基因组；通过荧光激活细胞分选（FACS）进行单细胞克隆；运用定量聚合酶链反应（qPCR）分析整合的转基拷贝数；采用摇瓶补料分批培养评估细胞系的生长和抗体生产能力；使用蛋白A亲和高效液相色谱（HPLC）和基于荧光共振能量转移（FRET）技术的荧光法对培养上清液中的mAb浓度进行定量检测^[Methods]。

研究结果方面，在生成稳定细胞池时，通过转染pT2HC(A, B) - CHX、pT2LC(A, B) - Neo和pKT2TP到悬浮CHO细胞，经CHX抗性筛选后，观察到所有孔均形成CHX抗性克隆。测量的抗体浓度显示，mAb - A转染细胞的抗体浓度范围为3.8 - 44.7 mg/L（中位数11.9 mg/L），mAb - B为1.2 - 33.7 mg/L（中位数13.1 mg/L）。选择抗体产量较高的前96个细胞池进行进一步培养和检测，抗体浓度在mAb - A中范围为40.7 - 92.4 mg/L（中位数78.4 mg/L），mAb - B中为9.5 - 29.1 mg/L（中位数19.8 mg/L）^[Fig.2]。对CHX抗性细胞池衍生的克隆细胞系进行评估，成功筛选出mAb - A的6个克隆细胞系（A - 1 - A - 6）和mAb - B的4个克隆细胞系（B - 1 - B - 4），这些细胞系在补料分批培养中表现出良好的生长和抗体生产能力，mAb - A的最大细胞密度为98.1 - 224.6×10⁵ cells/mL，抗体生产滴度为3.6 - 4.6 g/L；mAb - B的最大细胞密度为54.5 - 221.4×10⁵ cells/mL，抗体生产滴度为3.2 - 3.8 g/L^[Fig.3]。长期稳定性分析表明，在12周的培养过程中，mAb - A和mAb - B细胞系均能保持一致的抗体生产力，A - 1细胞系的抗体浓度为298.2 - 396.7 mg/L，B - 1细胞系为82.6 - 190.2 mg/L等，且特定抗体生产力稳定^[Fig.4]。对HC和LC构建体整合拷贝数的分析显示，mAb - A细胞系中pT2HC(A) - CHX拷贝数为19 - 31，pT2LC(A) - CHX为18 - 39；mAb - B细胞系中pT2HC(B) - CHX为3 - 5，pT2LC(B) - CHX为1 - 2，且在12周培养期间拷贝数稳定^[Fig.5]。

研究结论和讨论部分强调了该方法的重要意义。研究表明，通过分别共转染携带mAb的HC和LC基因的转座子供体载体，可创建高产细胞系，且HC和LC构建体的拷贝数因mAb而异，不同拷贝数可能对不同mAb的生产是最佳的。该方法简化了从携带各种基因组位点整合的高产细胞池中选择高产细胞系的过程，增加了定位到稳定生产力和细胞活力的基因组位点的可能性。与传统的RMCE和CRISPR/Cas9方法相比，该方法无需预先考虑靶点，利用转座子可整合到多个位点的特性，通常能实现更高的生产力，且仅用单一药物进行选择，减少了操作复杂性和对细胞的压力。此外，该方法在无LC构建体选择压力的情况下仍能筛选出高产细胞系，为解决难表达（DTE）抗体的问题提供了可能，有望促进生物制药生产的发展^[Discussion]。该研究为多亚基蛋白在CHO细胞中的高效生产提供了新的思路和方法，对未来生物制药领域的发展具有重要意义。