细菌接合关键复合体松弛体的冷冻电镜结构解析揭示抗生素耐药基因传播机制

本研究通过冷冻电镜技术首次解析了F质粒编码的松弛体（relaxosome）两种功能状态的高分辨率结构，揭示了其在细菌接合（conjugation）和抗生素耐药基因（AMR）传播中的核心作用。研究阐明了Tral蛋白的TE结构域与DNA解旋的分子机制，发现DNA拓扑U型转折是激活松弛体的关键，为阻断耐药基因扩散提供了新靶点。

　　

细菌接合是自然界中水平基因转移的重要方式，也是抗生素耐药性（AMR）基因传播的主要推手。这一过程依赖三个核心复合体：松弛体（relaxosome）、IV型分泌系统（T4SS）和菌毛（pilus）。尽管T4SS和菌毛的结构已被解析，但负责DNA加工的松弛体结构长期未明。F质粒作为大肠杆菌中耐药基因（如历史上的R因子）的主要载体，其松弛体由质粒编码的Tral（含松弛酶和解旋酶结构域）、TraY、TraM及宿主蛋白IHF组成，在oriT位点形成精密的功能组装体。

伦敦大学伯贝克学院和奥地利科学基金的研究团队通过冷冻电镜技术，首次捕获了F质粒松弛体在两种功能状态下的高分辨率结构。研究采用DNA酶I足迹法鉴定蛋白结合位点，设计系列ss/dsDNA杂交底物解析构象变化，结合位点突变验证功能枢纽。

结果部分
松弛体组装与DNase I足迹分析
通过纯化组分重构松弛体复合物，发现其保护区域覆盖oriT₃₁₆的nic位点至tral_TE、IHF_a、sby_C/A等位点，由此设计170bp的ds₂₇₊₁₄₃ DNA用于结构解析。

松弛体冷冻电镜结构
3.78?分辨率结构显示，IHF诱导DNA形成不对称U型发夹：TraY结合臂（bp +43至+94）上有三个TraY分子形成"蛋白列车"，nic臂（bp +12至+42）则通过VH_{2A+2B/2B-like}与DNA互作。这种拓扑转折使nic位点移动29?，为切割创造条件。

全组装松弛体结构
采用ss₂₇₊₈ds_{+9_+143}底物获得3.45?结构，首次观察到Tral的TE结构域同时结合ssDNA（-2至+9）和dsDNA（+10至+15），其β9-αF环可解离+9碱基对。通过缺失TraM或Tral_AH+CTD的对照实验，定位了TraM与Tral CTD的互作区域。

功能枢纽分析
研究发现四个关键互作枢纽：

• 枢纽1：IHF/Tral_VH/TraY1形成8000?²界面，IHF通过β发卡插入DNA小沟诱导160°弯曲
• 枢纽2：三个TraY分子通过RHH结构域与DNA互作，总埋面达2833?²
• 枢纽3：TE结构域通过β10-β11区诱导T链U型转折
• 枢纽4：TraM通过NTD结合DNA，CTD连接T4SS耦合蛋白TraD

Tral构象转换机制
比较Tral_TE（结合nic 5'端）与Tral_Helicase（结合3'端）模式，发现VH亚域发生47°-95°旋转。实验证实TE结构域需在nic位点3'侧形成单链"气泡"才能有效结合，插入poly-dT₁₅可模拟该激活状态。

突变验证
对枢纽1-3的界面残基进行突变（如S641E/S696E），发现部分突变使接合效率提升300倍，提示这些枢纽维持了松弛体的"待机状态"，易受外界信号触发。

讨论与意义
该研究首次完整揭示了松弛体的分子架构，提出接合启动的级联反应模型：静息态松弛体被招募至T4SS后，通过菌毛接触受体细胞触发DNA局部解链，Tral_TE切割nic位点并共价连接DNA，同时Tral_Helicase解旋双链完成转移。研究不仅阐明了F质粒的传播机制，其发现也适用于IncN、IncW等质粒家族——这些质粒的松弛酶TE结构域具有保守折叠。

这项发表于《Nature Communications》的工作为开发针对AMR传播的抑制剂提供了精确的分子蓝图。例如，靶向枢纽1的IHF-DNA界面或枢纽3的TE解旋活性，可能阻断耐药基因扩散。该结构生物学突破也为理解其他革兰阴性菌（如铜绿假单胞菌）的基因转移机制奠定了基础。