MEK抑制通过协同激活JNK信号通路增强结肠癌细胞对生长因子的响应机制

为解决靶向激酶抑制剂治疗癌症时因信号网络复杂性导致的耐药性问题，研究人员开发了SPIED-DIA技术（结合DIA质谱与合成重标磷酸肽增强检测），揭示了MEK抑制剂（MEKi）通过EGFR反馈环路协同激活JNK信号通路的机制，为结肠癌联合靶向治疗提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，靶向激酶抑制剂虽取得显著进展，但细胞信号网络的复杂反馈机制常导致耐药性。以结肠癌为例，MEK抑制剂（MEKi）虽能阻断MAPK通路，却可能通过EGFR等受体反馈激活平行通路（如PI3K/AKT），限制疗效。这种“按下葫芦浮起瓢”的困境，亟需深度解析信号响应机制以开发联合疗法。传统磷酸化蛋白质组学虽能全局分析信号网络，但低丰度关键磷酸化位点的漏检、数据解读复杂性及耗时问题制约其应用。

针对这一挑战，德国马克斯·德尔布吕克分子医学中心等机构的研究团队在《Nature Communications》发表研究，开发了SPIED-DIA技术（Spike-in enhanced detection in DIA），将合成重标磷酸肽（heavy stable isotope-labeled phosphopeptides）与数据非依赖采集（DIA）质谱结合，实现了高灵敏度靶向检测与全局磷酸化分析的融合。该技术成功应用于11种结肠癌细胞系的MEKi响应研究，首次揭示MEK抑制会协同增强生长因子（EGF/HGF/FGF2）诱导的JNK信号激活，并通过体外实验验证MEKi与JNK抑制剂（JNKi）联用可显著抑制KRAS突变型HCT116细胞增殖，为克服耐药性提供了新靶点组合。

研究主要采用四项关键技术：1）SPIED-DIA工作流（合成485种通路相关磷酸肽作为内标，结合DIA-PASEF质谱）；2）CRC细胞系面板筛选（11种细胞系+7种生长因子刺激+MEKi处理）；3）磷酸化信号定量分析（DIA-NN算法与limma差异分析）；4）活细胞成像验证（Incucyte监测MEKi/JNKi联用效果）。

Spike-in enhanced detection提升DIA磷酸化组学灵敏度
通过稀释实验验证，SPIED-DIA使目标磷酸肽检出率提升2-3倍（图1D）。重标肽作为“信标”辅助鉴定低丰度内源肽，其强度比（L/H）在1:255稀释梯度下仍保持线性（图1E）。合成的磷酸肽库覆盖AKT、ERK等关键通路节点（图1F），在HEK293模型中使靶标位点检出数从12（常规DIA）提升至40个（图1G）。

CRC细胞系筛选揭示MEKi依赖性协同激活
生长因子刺激联合MEKi处理显示，KRAS突变细胞（HCT116/DLD-1）出现AKT^S473的协同激活（图2C），而KRAS野生型Caco2无此效应。Luminex定量证实EGF/HGF/FGF2均可介导该现象（图2D），提示多受体参与反馈调节。

靶向磷酸化分析锁定JNK协同激活
SPIED-DIA在HCT116中检测到JNK1^T185/^Y187（激活环磷酸化）的显著协同上调（图4E），且该效应经全局磷酸化数据验证（图5A）。激酶活性分析（PTM-SEA）显示JNK底物富集于协同响应簇（p<0.01），而体外激酶图谱（Johnson库）进一步确认JNK基序偏好性（图5C）。单因子实验表明EGF/HGF/FGF2（非VEGF-C）均可触发此效应（补充图15）。

功能验证揭示联合治疗潜力
活细胞成像显示，1μM JNKi与0.2μM MEKi联用使HCT116细胞倍增时间从25小时延长至37小时（图6D），显著强于单药效果。而DLD-1细胞因JNK信号响应较弱，仅对MEKi+PI3Ki敏感（图6B），凸显细胞特异性通路重编程。

该研究通过创新技术SPIED-DIA破解了低丰度磷酸化位点检测难题，首次报道MEKi通过生长因子受体反馈协同激活JNK的非经典机制。这一发现不仅解释了KRAS突变CRC的耐药性差异，更提出“MEKi+JNKi”的精准联合策略。从转化医学角度看，SPIED-DIA技术可扩展至临床样本分析（如FFPE组织微尺度磷酸化检测），为个体化治疗提供信号通路层面的决策依据。研究同时提示，不同CRC亚型可能存在独特的反馈激活模式，未来需基于更大样本验证JNK通路的治疗预测价值。

（注：全文细节均源自原文，技术术语首次出现时标注英文，保留^{/_{格式，去除了文献引用标识）}}