基于SWATH/DIA-MS的耗竭依赖性活性蛋白质组学揭示肺腺癌进展中丝氨酸水解酶介导的脂质重塑机制

本研究针对传统蛋白质组学无法检测酶活性状态的局限，开发了耗竭依赖性活性蛋白质组分析(dd-ABPP)结合SWATH/DIA-MS技术，在III期肺腺癌(LUAD)组织中发现23个丝氨酸水解酶(SHs)活性变化与59个相关蛋白构成的分子特征，揭示了棕榈酰蛋白水解酶活性增强导致的脂蛋白去棕榈酰化加速是侵袭性LUAD的标志，为肿瘤分类提供了新思路。

　　

在肿瘤生物学领域，酶活性的动态调控是影响癌症进展的关键因素，但传统蛋白质组学仅能检测酶的表达量，对活性状态"视而不见"。这就像只统计工厂里机器的数量，却不知道哪些机器正在运转。肺腺癌(LUAD)作为最具侵袭性的肺癌类型，其III期患者的生存期差异巨大，现有基于基因突变或蛋白表达的诊断方法难以准确预测疾病进展。更棘手的是，手术标本通常采用OCT包埋处理，而常规质谱技术无法在保持酶活性的前提下分析这类样本。

针对这些挑战，研究人员开发了创新的耗竭依赖性活性蛋白质组分析(dd-ABPP)技术，结合数据非依赖采集质谱(SWATH/DIA-MS)，首次实现了在临床常规处理的OCT包埋组织中同步检测三个分子层面信息：催化活性酶比例、总酶量和环境依赖性蛋白互作网络。这项研究纳入了16例III期LUAD患者的配对肿瘤和癌旁组织，通过5年随访将患者分为长期生存(>5年)和短期生存(<1年)两组。

关键技术包括：1)优化OCT包埋组织的活性酶提取方案；2)FP-biotin探针标记活性SHs后通过亲和耗竭分离；3)SWATH/DIA-MS平行分析耗竭前后样本；4)建立包含215个SHs的靶向谱库；5)整合脂质组学和金属组学数据。通过计算活性依赖耗竭指数(RADDi)量化酶活性变化。

研究结果首先显示，传统蛋白质组分析仅发现5个SHs表达差异，而dd-ABPP在131个检测SHs中鉴定出72个具有活性变化。在"活性指纹区分LUAD生存亚型"部分，发现肿瘤组织中活性SHs数量是癌旁组织的两倍(46-47 vs 18-22)，其中PREP、LYPLA1等酶活性提升2-3倍。特别值得注意的是，侵袭性肿瘤中LYPLA2、ABHD12等棕榈酰蛋白水解酶活性显著降低。

"验证SH活性谱的正交技术"部分通过三种独立方法验证结果：荧光探针标记显示肿瘤整体水解活性增强；标准ABPP证实SIAE、FASN等5个关键酶活性升高；功能实验测得DPP4和ELANE蛋白酶活性与质谱数据一致。其中ELANE活性与蛋白表达无相关性(rho=-0.04)，凸显了检测活性的必要性。

"dd-ABPP蛋白质组数据集证实侵袭性LUAD中蛋白质去棕榈酰化加速"部分通过蛋白互作网络分析发现，59个差异蛋白中49.2%是已知棕榈酰化蛋白，远高于人类蛋白质组7%的基础比例。多组学整合模型显示"大分子去棕榈酰化"通路显著富集，包含ABHD12、LYPLA2等关键水解酶。

后续"FA分析显示侵袭性表型中棕榈酸及其代谢物过量"证实，侵袭性肿瘤中棕榈酸(16:0)浓度显著升高(p=0.006)，其去饱和产物棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)也增加。SCD1蛋白表达上调进一步验证了棕榈酸去饱和过程增强。

最后"SH催化活性程度与LUAD分子组成相关"部分发现，ELANE活性与组织Cr、Al含量正相关，而NUP98活性与Hg含量负相关。TCGA数据分析显示LYPLA2等棕榈酰水解酶基因与KRAS突变显著共现(p<0.01)。

这项研究的意义在于：1)建立了兼容临床样本的酶活性分析新方法；2)发现棕榈酰水解酶活性特征可区分LUAD侵袭性；3)揭示脂质重塑与肿瘤进展的新关联。技术层面，dd-ABPP将可检测SHs数量从78提升至131个，且能发现表达量不变但活性改变的酶。生物学层面，证明蛋白质去棕榈酰化失衡和棕榈酸代谢重编程共同促进肿瘤恶性进展，为LUAD的诊疗提供了新靶点。该方法可推广至其他酶家族研究，为理解肿瘤异质性开辟了新途径。