多重碱基编辑技术保护免疫与基因治疗中 CD33 靶向药物的正常细胞

为解决基因编辑后体内工程免疫或造血干细胞的选择及正常细胞脱靶毒性问题，研究人员开发碱基编辑方法，利用 CD33 单核苷酸多态性（SNP）去除编辑细胞全长 CD33 表面表达。结果显示其保护髓系子代免受 CD33 靶向治疗影响，且实现 CD33 与 γ 珠蛋白基因高效多重腺嘌呤碱基编辑，为免疫与基因治疗提供新策略。

　　

在癌症免疫治疗蓬勃发展的当下，靶向药物虽展现出巨大潜力，却面临一个棘手难题 —— 缺乏肿瘤特异性抗原，这使得正常细胞常遭受 “无差别攻击”，引发严重的脱靶毒性。以血液系统恶性肿瘤治疗为例，靶向抗原在正常造血细胞上的表达，可能导致长时间的严重骨髓抑制，进而引发低丙种球蛋白血症、威胁生命的出血或感染等一系列不良后果。就 CD33 靶向免疫治疗而言，CD33 作为一种在急性髓系白血病（AML）肿瘤细胞上广泛表达的髓系分化抗原，其在正常造血干细胞和祖细胞（HSPCs）上的表达，使得如何在发挥治疗作用的同时保护正常细胞成为亟待解决的科学问题。传统的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术虽能有效编辑基因，但其基于双链断裂（DSB）的机制可能带来诸如 p53 激活、大片段插入 / 缺失以及染色体易位等潜在风险，尤其在 HSPCs 等细胞类型中，这些风险的长期影响尚不确定，同时多重基因编辑时多个基因的 DSB 还可能增加未知功能的染色体易位风险。因此，开发一种更安全、精准的基因编辑方法，以保护正常细胞免受靶向药物毒性，同时实现高效的基因编辑和细胞选择，成为该领域的研究热点。

为应对上述挑战，来自哥伦比亚大学欧文医学中心、弗雷德?哈钦森癌症中心等机构的研究人员开展了相关研究。他们开发了一种基于碱基编辑（Base Editing, BE）的创新方法，利用天然存在的 CD33 单核苷酸多态性（SNP），通过腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e）实现 CD33 外显子 2 的跳跃，从而去除编辑细胞表面全长 CD33（CD33^FL）的表达。研究成果发表在《Nature Communications》上，为免疫治疗和基因治疗提供了新的思路和策略。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：

1. 碱基编辑技术：使用腺嘌呤碱基编辑器 ABE8e 和胞嘧啶碱基编辑器 BE4max，针对 CD33 基因的外显子剪接受体位点和外显子剪接增强子位点进行编辑，诱导外显子 2 跳跃，同时结合 γ 珠蛋白基因（HBG）启动子区域的编辑，实现多重基因编辑。
2. 细胞模型与动物实验：利用人类和非人类灵长类动物（NHP）的 HSPCs 进行体外编辑和体内移植实验，通过小鼠异种移植模型和 NHP 自体移植模型，评估编辑细胞的造血重建能力、对 CD33 靶向药物的抗性以及长期持久性。
3. 流式细胞术与分子生物学检测：通过流式细胞术检测细胞表面 CD33 表达、造血细胞谱系分化情况，利用 RT-PCR、高通量测序（HTS）等技术分析基因编辑效率和脱靶效应。

结果

1. CD33 外显子 2 跳跃的碱基编辑策略

CD33 的全长异构体（CD33^FL）由 7 个外显子组成，目前大多数抗 CD33 治疗药物（如 GO）靶向的表位位于外显子 2 编码的 V-set 结构域。天然存在的 SNP（rs12459419）通过将外显子 2 剪接增强子（ESE）位点的 C 替换为 T，导致外显子 2 跳跃，产生缺少该外显子的短异构体（CD33Δ2）。研究人员利用 ABE8e 靶向 CD33 外显子 2 的剪接受体位点，实现了高达 95% 的编辑效率，且几乎无插入 / 缺失（indels），而 BE4max 编辑虽能降低 CD33 表达，但伴随较高的 indels 频率。RT-PCR 和流式细胞术结果显示，ABE8e 编辑的 HSPCs 几乎完全不表达 CD33^FL，但保留正常的吞噬功能。

2. CD33 编辑细胞对靶向药物的抗性与体内造血重建

在体外实验中，ABE8e 编辑的 CD34⁺细胞对 GO 和 CD33/CD3 双特异性 T 细胞衔接器（BiAb）表现出显著抗性，而未编辑细胞则对这些药物高度敏感。在小鼠移植模型中，编辑细胞能够正常植入并重建完整的造血系统，包括髓系、淋系等细胞谱系，且 CD33 编辑效率在体内长期维持。给予 GO 治疗后，未编辑细胞来源的髓系细胞被大量清除，而编辑细胞来源的 CD33^?髓系细胞得以保留，证实了编辑细胞在体内对 CD33 靶向药物的抗性。

3. CD33/HBG 多重碱基编辑与细胞富集

研究人员进一步尝试同时编辑 CD33 和 γ 珠蛋白基因（HBG），以探索其在血红蛋白病治疗中的应用。通过 ABE8e-NG 变体靶向 HBG 启动子?175 位点，该位点的编辑可通过创建转录激活因子 TAL1 的结合位点，重新激活胎儿血红蛋白（HbF）的表达。在多重编辑实验中，CD33 和 HBG 的编辑效率分别达到 75% 和 40% 左右，且超过 75% 的克隆同时携带两种编辑。在 ML1 白血病细胞模型中，GO 处理可使双重编辑细胞的频率提高 2 倍，显示出 CD33 编辑介导的细胞富集潜力。在 NHP 自体移植模型中，编辑的 CD90⁺HSPCs 能够长期植入并重建造血系统，编辑细胞在血液和骨髓中持续存在，且 HbF 水平显著升高。

4. 脱靶效应分析

通过 CIRCLE-seq 和 HTS 技术对单重和多重编辑细胞进行脱靶分析，发现 ABE8e 编辑存在一定的脱靶位点，但大多数位于基因间或内含子区域，仅有少数位于外显子或剪接位点，且未观察到对造血功能的明显影响。研究人员指出，未来可通过优化编辑器版本或降低剂量来减少脱靶效应。

结论与讨论

本研究开发的 ABE8e 介导的 CD33 编辑策略，通过模拟天然 SNP 诱导外显子 2 跳跃，在不影响正常造血功能的前提下，有效保护 HSPCs 及其髓系子代免受 CD33 靶向药物的毒性，为解决免疫治疗中的脱靶问题提供了新途径。同时，CD33/HBG 多重编辑在小鼠和 NHP 模型中实现了双重编辑细胞的高效生成和长期维持，结合 CD33 靶向药物的富集作用，为血红蛋白病等遗传疾病的基因治疗提供了创新策略。

碱基编辑技术因其不依赖 DSB 的特性，在避免染色体异常风险方面展现出显著优势，尤其适用于多重基因编辑。尽管脱靶效应仍需进一步优化，但本研究在非人类灵长类动物中的成功验证，为其临床转化奠定了坚实基础。未来，该技术有望拓展至其他靶点和疾病领域，如通过编辑 HSPCs 表面的其他抗原（如 CD45、CD123 等），开发更安全有效的靶向免疫治疗和基因治疗方法，为癌症和遗传疾病的治疗带来新的希望。