编辑推荐：
本文聚焦铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）染色体 β- 内酰胺酶 AmpC（PDC）氨基酸变异，探究其对头孢地尔（cefiderocol）等抗生素耐药的影响。发现 E219K 和 L293P 变异通过不同酶学机制增强头孢地尔水解，为临床应对耐药提供新视角。
研究背景与目的
铜绿假单胞菌是革兰氏阴性病原菌，其通过水平基因转移获得广谱耐药机制（如超广谱 β- 内酰胺酶 ESBLs、金属 β- 内酰胺酶）的能力令人担忧。新型 β- 内酰胺 /β- 内酰胺酶抑制剂组合（如头孢他啶 / 阿维巴坦、头孢洛扎 / 他唑巴坦）虽已上市，但耐药菌株不断涌现。头孢地尔是近年获批的新型 β- 内酰胺抗生素，其独特的氯邻苯二酚基团可通过铁载体介导途径穿透周质空间（“特洛伊木马” 机制），但对其耐药机制的研究尚不充分，尤其是铜绿假单胞菌固有 PDC β- 内酰胺酶的氨基酸变异影响。本研究旨在解析 PDC 变异对头孢地尔耐药的分子机制。
材料与方法
利用构建的野生型（PAO1）和铁摄取缺陷型（PAO ΔpiuC）铜绿假单胞菌分离株，表达 19 种 PDC 关键催化区域变异体。通过肉汤微量稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（MIC），纯化 PDC-1、E219K 和 L293P 变异体并测定动力学参数（Km、kcat、kcat/Km），结合分子动力学（MD）模拟分析变异体结构变化。
关键结果
1. PDC 变异对头孢地尔耐药的不同影响
多数 PDC 变异体对头孢地尔 MIC 影响较小，但 Ω-loop 的 E219K 和螺旋 H10 的 L293P 变异显著升高头孢地尔 MIC。在 PAO ΔpiuC背景下，E219K、L293P 等变异体的头孢地尔 MIC 达 32–64 mg/L。E219K 对头孢洛扎 / 他唑巴坦耐药影响显著，而 L293P 更倾向于影响头孢吡肟和头孢地尔耐药。
2. 动力学机制差异
- E219K 变异：通过提高催化速率（kcat）增强水解能力，其对头孢地尔的kcat较野生型提高约 125 倍（从 0.0036 s-1至 0.45 s-1），但底物结合亲和力（Km）下降（从 85.29 μM 至 465.64 μM）。
- L293P 变异：通过降低Km提升底物结合亲和力，对头孢地尔的Km降至 2.69 μM（野生型 85.29 μM），kcat/Km提高 33.75 倍。
3. 结构机制解析
MD 模拟显示，E219K 通过增强 Ω-loop 刚性，促进头孢地尔 R1基团与催化丝氨酸的亲核攻击；L293P 使螺旋 H10 折叠减少，通过与头孢地尔 R2基团形成更强氢键，优化活性位点结合。E219K 的 Ω-loop 与螺旋 H5 的 E171 形成静电作用，限制构象灵活性；L293P 则增加 H9–H10 环柔性，扩大结合口袋。
讨论与意义
本研究揭示 PDC 的 E219K 和 L293P 变异分别通过 “提高催化效率” 和 “增强结合亲和力” 两条路径介导头孢地尔耐药，且与头孢洛扎、头孢吡肟等存在交叉耐药机制。临床需警惕铜绿假单胞菌在抗生素压力下通过 PDC 变异快速进化耐药性，尤其是铁摄取缺陷与 PDC 变异协同导致的高 MIC 表型。研究为预测耐药进化、开发新型抑制剂提供了结构与机制依据，强调动态监测 PDC 变异在抗铜绿假单胞菌治疗中的重要性。
结论
PDC β- 内酰胺酶可通过 E219K 和 L293P 变异利用头孢地尔与其他头孢菌素的结构相似性加速水解，展现了铜绿假单胞菌耐药机制的复杂性与适应性。未来需结合临床菌株监测与结构生物学手段，进一步优化抗生素使用策略，延缓耐药性传播。
