白尾鹿鼠骨髓源性巨噬细胞分化模型的建立及其对伯氏疏螺旋体与脂多糖的免疫应答特征解析

本研究首次建立了白尾鹿鼠(Peromyscus leucopus)骨髓源性巨噬细胞(BMDM)分化体系，通过构建M-CSF分泌型HEK293T细胞，成功实现与C57BL/6J小鼠相当的巨噬细胞分化效率。RNA测序揭示该物种对伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和脂多糖(LPS)刺激存在独特转录组特征，包括IL-10诱导差异和半胱天冬酶(Caspase)表达谱变化，为理解这种重要人畜共患病宿主的免疫耐受机制提供了新工具。

　　

ABSTRACT
作为北美最丰富的哺乳动物，白尾鹿鼠(Peromyscus leucopus)是莱姆病螺旋体等众多人畜共患病病原体的关键储存宿主。研究首次利用表达鹿鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的HEK293T细胞，成功分化其骨髓前体细胞为功能性巨噬细胞。与C57BL/6J小鼠相比，两种物种的巨噬细胞在基础状态下表现相似，但对伯氏疏螺旋体(B31株)和沙门氏菌LPS的刺激呈现差异转录响应，特别是IL-10诱导和半胱天冬酶表达模式的种间差异。

INTRODUCTION
白尾鹿鼠展现对多种病原体的非凡耐受性，包括伯氏疏螺旋体感染时不出现人类莱姆病的典型关节肿胀症状。这种特性与其控制炎症反应的能力密切相关，但具体机制尚未阐明。现有研究多采用全组织或皮肤成纤维细胞，难以解析特定免疫细胞亚群的作用。本研究旨在建立鹿鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)培养体系，为宿主-病原体互作研究提供细胞模型。

MATERIALS AND METHODS
实验采用年龄/性别匹配的C57BL/6J小鼠和实验室培育的白尾鹿鼠。通过慢病毒载体将鹿鼠Csf1基因转入HEK293T细胞，建立稳定分泌M-CSF的细胞系。骨髓细胞分别在L-929(小鼠)或HEK293T^M-CSF(鹿鼠)条件培养基中分化6天，通过Cd68和Kit基因表达验证分化效率。采用共聚焦显微镜观察伯氏疏螺旋体吞噬过程，并通过pH敏感荧光珠和DQ-BSA/AF594珠检测吞噬体成熟度。RNA测序分析B31株(MOI=100)或LPS(100 ng/mL)刺激10小时后的转录组变化。

RESULTS
Development of a P. leucopus BMDM differentiation method
鹿鼠与小鼠M-CSF蛋白序列相似度达81.9%，但小鼠L-929上清无法诱导鹿鼠骨髓分化。成功构建的HEK293T^M-CSF细胞可使鹿鼠前体细胞形成典型巨噬细胞形态，流式检测显示分化过程中细胞大小变化趋势与小鼠一致。RT-qPCR证实分化细胞Cd68表达上调而Kit下降，验证模型有效性。

P. leucopus BMDMs have similar polarization under unstimulated conditions to C57BL/6J BMDMs
基线状态下，主成分分析(PCA)显示两物种转录组存在差异，但经典M1/M2极化标志物表达无统计学差异，表明分化体系可比性良好。

P. leucopus BMDMs have similar proteolysis but potentially altered phagosome acidification to C57BL/6J BMDMs
吞噬实验显示两物种对伯氏疏螺旋体的内化效率无差异，LAMP1溶酶体标记共定位率相似。但pH敏感荧光检测发现鹿鼠巨噬细胞吞噬体酸化程度显著低于小鼠，而蛋白水解活性相当，提示吞噬体成熟过程存在种间差异。

P. leucopus and C57BL/6J BMDMs exhibit modest differences in their transcriptomic profiles following B. burgdorferi stimulation
伯氏疏螺旋体刺激后，鹿鼠特异性上调Il1r1/2、Il18等炎症相关基因，而小鼠显著上调Casp1。通路分析显示鹿鼠中IL-12和伤口愈合信号激活，而小鼠KEAP1-NFE2L2通路更活跃。值得注意的是，鹿鼠下调Casp1同时上调Il1b，可能通过调控 pyroptosis 通路影响炎症强度。

P. leucopus and C57BL/6J BMDMs exhibit modest differences in their transcriptomic profiles following LPS stimulation
LPS刺激揭示鹿鼠特异性高表达Il10、Il10ra和Rab11a（内体循环相关基因），而小鼠更显著激活Casp7和IL-7信号。与体内数据对比发现，鹿鼠BMDM和肝脏均表现Casp3上调特征，与血液转录组相关性(r²=0.22)优于成纤维细胞模型(r²=0.035)。

DISCUSSION
该研究突破性地建立了鹿鼠BMDM培养体系，揭示其对病原体刺激的独特转录调控模式：1）通过差异表达Caspase家族成员（如抑制Casp1但激活Casp3）精细调控细胞死亡通路；2）强化IL-10等抑炎因子表达；3）增强Rab11a介导的内体循环。这些发现为理解自然宿主对伯氏疏螺旋体的免疫耐受提供了新视角，未来可拓展至其他鹿鼠携带的病原体（如波瓦桑病毒、嗜吞噬细胞无形体）研究。当前局限包括样本量较小和鹿鼠基因组注释不完善，但HEK293T^M-CSF细胞系的建立为后续研究奠定了关键技术基础。