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问题二
本研究利用酵母系统筛选细菌效应蛋白和人类病毒蛋白，发现自噬通路及膜磷脂（如磷脂酰乙醇胺 PE）对番茄丛矮病毒（TBSV）RNA 重组至关重要，且 SARS-CoV-2 N 蛋白和 HMPV M2-1 蛋白通过抑制宿主 Xrn1 外切酶促进重组，为病毒进化机制提供新视角。
问题五
研究背景与目的
正义链（+）RNA 病毒利用宿主细胞资源进行复制，其 RNA 重组是病毒进化和产生新变体的关键。宿主因子在重组中起重要作用但机制不明。本研究通过在酵母中表达军团菌效应蛋白、SARS-CoV-2 和人偏肺病毒（HMPV）蛋白，探究其对番茄丛矮病毒（TBSV）RNA 重组的影响，揭示宿主通路与病毒重组的关联。
关键筛选与发现
通过筛选 113 个军团菌效应蛋白，发现 16 个显著影响 TBSV 重组，其中 7 个同时影响复制。这些效应蛋白靶向肌动蛋白网络、自噬通路（如 RavZ、LegA9 抑制自噬）、Rab GTP 酶等宿主途径。筛选 27 个 SARS-CoV-2 蛋白和 8 个 HMPV 蛋白，发现 6 个 SARS-CoV-2 蛋白（如 N 蛋白）和 2 个 HMPV 蛋白（M2-1、P）影响重组，其中 N 蛋白和 M2-1 通过保护病毒 RNA 免受宿主 Xrn1 5′?3′ 外切酶降解发挥作用。
自噬通路的作用机制
抑制自噬（如 RavZ、LegA9）减少 TBSV 重组，诱导自噬（如雷帕霉素处理、氮饥饿）则增强重组。过表达自噬相关脂质转移蛋白 ATG2 可促进重组，提示磷脂在重组中的作用。体外实验利用巨型单层囊泡（GUVs）证实，磷脂酰乙醇胺（PE）含量高的膜结构显著促进 RNA 重组，而 PI (3) P 和甾醇可增加异常 RNA 产物，表明自噬通过提供膜磷脂促进病毒复制细胞器（VROs）形成，进而影响重组。
病毒蛋白与宿主酶的互作
SARS-CoV-2 N 蛋白的 N 端结构域（NTD）和 C 端结构域（CTD）协同作用，通过与宿主 Xrn1 外切酶竞争结合病毒 RNA，保护其不被降解，从而增强 TBSV 和康乃馨意大利环斑病毒（CIRV）的复制与重组。HMPV M2-1 蛋白通过类似机制抑制 Xrn1 活性，但其锌结合域突变后功能丧失，表明其作用依赖 RNA 结合能力。
膜磷脂的体外验证
在 GUVs 复制系统中，含高比例 PE 的 “最小膜” 支持重组产物生成，而低 PE 的 “CIS 膜” 则抑制。添加 PI (3) P 和麦角甾醇的 ER 样膜虽促进正常复制，也增加异常 RNA，提示膜脂组成和蛋白 - 脂质比例通过影响病毒复制酶复合物的模板转换活性调控重组。
结论与意义
本研究揭示自噬通路通过调控膜磷脂（尤其是 PE）促进病毒 RNA 重组，而 SARS-CoV-2 N 蛋白和 HMPV M2-1 蛋白通过拮抗宿主 Xrn1 外切酶增强重组。TBSV / 酵母系统可作为通用传感器，用于鉴定异源病毒和细菌效应蛋白的宿主靶点，为理解 RNA 病毒进化和开发抗病毒策略提供新方向。
