完整基因组测序揭示嗜酸硫杆菌属潜在新成员M4 - SHS - 6的特性与意义

推荐 为明确嗜酸硫杆菌属潜在新成员特征，来自浙江万里大学的研究人员对从该校人工湖采集的水样中分离出的菌株M4 - SHS - 6进行研究。通过混合测序完成其全基因组测序，该研究为深入了解此类细菌提供了重要依据。

　　

翻译
菌株M4 - SHS - 6于2018年4月从中国浙江万里大学一个人造湖的表面水样本中分离出来（GPS：121.6°E，29.8°N）。取100 μL样本在含有Na₂S₂O₃作为唯一能量来源、pH为6.5的10 mL液体DSMZ培养基68中进行富集。表现出显著pH降低的富集培养物被转移到DSMZ培养基68 - 琼脂上，通过稀释平板法进行培养。在30°C下培养7天后，在DSMZ培养基68 - 琼脂平板上显示出黄色晕圈区域的一个菌落（命名为M4 - SHS - 6），通过反复划线进行纯化。

针对16S rRNA基因几乎全长进行菌落PCR，使用的引物为通用细菌引物27F和1492R^[1]。16S rRNA序列经过手动验证后存入GenBank（登录号：PQ637443）。EzTaxon - e分析^[2]表明，菌株M4 - SHS - 6与嗜酸硫杆菌属（Acidithiobacillus）的模式菌株序列相似度为94.2% - 98.4%，其中关系最近的为嗜酸铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferridurans）ATCC 33020^T（98.4%同一性；GenBank登录号：AJ278719）。

从对数生长期细胞中提取基因组DNA（CTAB法^[3]），用于Illumina和牛津纳米孔测序。Illumina文库使用NEXTflex Rapid DNA - Seq Kit（Bioo Scientific，美国）制备，并在Illumina HiSeq X Ten平台（Illumina Inc.，美国）上进行测序。产生了约1.46 Gb的原始数据，包含150 bp长的配对末端读长，共4,837,194条读长。这些读长经过SOAPnuke版本1.3.0^[4]进行质控和修剪，最终得到4,811,505条干净读长。对于纳米孔测序，使用g - TUBE对DNA进行片段化，并使用BluPippin（Sage Science，美国马萨诸塞州贝弗利）选择大于20 Kb的大DNA片段。纳米孔文库使用SQK - LSK109试剂盒（Oxford Nanopore Technologies，英国）制备，并加载到PromethION平台（Oxford Nanopore Technologies，英国）的R9.4.1流动池中进行测序。碱基识别使用Guppy版本4.0.15（Oxford Nanopore Technologies）完成。读长质量控制使用NanoPlot版本1.15.0完成，阈值（Q）设为>7^[5]。纳米孔测序产生了251,745条干净读长，平均长度为5,660 bp，N₅₀值为8,791 bp。

使用Unicycler版本0.4.8^[6]对两种读长类型进行混合组装，得到一个环状染色体（3,003,844 bp）和两个环状质粒pLA（8,964 bp）和pLB（3,693 bp），整体G + C含量为56.1%。经Plasflow^[7]和PLSDB数据库^[8]验证，pLA和pLB为质粒。基因组覆盖率达到99.68%，Illumina的平均深度为482.6×，纳米孔的平均深度为472.4×。对于所有软件，除另有说明外，均使用默认参数。通过NCBI PGAP^[9]进行基因组注释，预测出3,144个基因，包括2,993个蛋白质编码序列。M4 - SHS - 6与嗜酸硫杆菌属模式菌株之间的平均核苷酸同一性为70.1% - 80.5%，低于种间阈值（95.0%^[10]）。