GAK–Hsc70动态早期招募调控网格蛋白包被凹坑成熟：揭示内吞作用中曲率生成的新机制

这篇研究揭示了GAK–Hsc70复合物在网格蛋白介导的内吞作用（CME）早期阶段的关键作用。通过活细胞成像和功能突变分析，作者发现GAK通过其J结构域招募Hsc70，促进网格蛋白晶格动态重塑，驱动扁平到弯曲结构的转变，从而调控CCP（网格蛋白包被凹坑）的稳定和内陷。该研究为CME的分子机制提供了直接证据，并提出了能量依赖的曲率生成模型，对理解癌症和神经退行性疾病相关的内吞失调具有重要意义。

　　

研究背景

网格蛋白介导的内吞作用（CME）是细胞摄取营养物质、信号受体和膜蛋白的核心途径，其失调与癌症、神经退行性疾病密切相关。CME起始于网格蛋白在质膜上的组装，形成扁平网格蛋白包被凹坑（CCP），随后通过曲率生成和内陷最终形成网格蛋白包被囊泡（CCV）。然而，扁平到弯曲结构的转变机制长期存在争议。GAK（cyclin G-associated kinase）及其伴侣蛋白Hsc70（Heat shock cognate protein 70）已知参与CCV解包被，但早期功能证据匮乏。

研究意义

本研究通过高分辨率成像和遗传学手段，首次证实GAK–Hsc70在CCP早期成熟阶段的动态招募通过ATP依赖的网格蛋白晶格重塑驱动曲率生成，为CME的形态转变提供了分子解释。

研究方法与发现

GAK敲除抑制CCP成熟

在ARPE-HPV eGFP-CLCa细胞中，siRNA敲低GAK导致转铁蛋白受体（TfnR）内吞效率显著降低。通过全内反射荧光显微镜（TIR-FM）和cmeAnalysis软件定量分析，发现GAK缺失导致CCP稳定性下降，流产凹坑比例增加，且CCP内陷深度（Δz）显著降低。

结构域特异性功能解析

构建GAK功能域突变体（Kinase*、PTEN*、clathrin*、AP2*、J*）发现：

• J结构域：HPD基序突变（J*）完全破坏Hsc70招募，导致CCP寿命缩短、亮度降低，内陷受阻，表型与小分子抑制剂MAL3-101处理一致。
• 网格蛋白结合域：突变后CCP启动率下降，但内陷未受影响，提示其独立于Hsc70的支架作用。
• 激酶域、PTEN样域和AP2结合域突变无显著影响，表明GAK的早期功能依赖Hsc70活性而非磷酸化或脂质结合。

动态招募模型

双通道TIR-FM显示：

• 野生型GAK：在CCP生长期间短暂招募，伴随Hsc70介导的网格蛋白解离；
• J*突变体：持续滞留于CCP，阻碍晶格动态重塑。
  这一“招募-解离”循环为曲率生成提供能量，支持“六边形→五边形”晶格重构假说。

机制模型与讨论

GAK–Hsc70通过以下步骤调控CCP成熟：

1. 早期阶段：GAK通过网格蛋白结合域定位至新生CCP，J结构域激活Hsc70 ATP酶，局部解离网格蛋白三脚体，促进曲率生成；
2. 晚期阶段：PTEN样域感知磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P），稳定GAK以完成CCV解包被。

该研究还提出：

• 神经元特异性辅助蛋白auxilin在非神经元细胞中无法补偿GAK功能；
• 流产CCP的快速解离可能由自发或auxilin–Hsc70独立途径介导。

研究局限与展望

尽管证实了GAK–Hsc70的曲率生成作用，但其他路径（如直接五边形插入）未被排除。未来需结合超分辨成像（如STED）或冷冻电镜进一步解析晶格动态。

实验方法亮点

• Epi-TIRF联用：首次定量CCP内陷深度Δz，揭示GAK缺失导致曲率缺陷；
• DASC算法：无偏分类流产CCP与成熟CCP，提升表型分析精度；
• 基因编辑细胞系：稳定表达荧光标记蛋白，避免过表达假象。

这项研究不仅深化了对CME机制的理解，还为靶向内吞途径的疾病治疗（如抑制肿瘤细胞受体内化）提供了新思路。